葡萄炭疽病菌对苯醚甲环唑敏感性基线建立及抗药性分子机制(3)
4) 将离心管放入球磨仪（MM400，Retsch）中，震荡2 次，每次2 min（震荡频率为28次/秒），此过程要注意配平；
5) 60℃水浴1 h，每隔20 min将离心管上下混匀震荡数次；
6) 加入700μL体积的氯仿充分震荡后12000 rpm离心5 min；
7) 抽取上清450μL转入1.5 mL离心管中；
8) 加入900μL无水乙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃沉淀1.5h以上；
9）12000 rpm，4℃离心5 min，弃上清，沉淀用75%的乙醇洗涤2次，自然风干后溶于40 μL ddH2O中，-20℃保存备用。
1.5.2 苯醚甲环唑抗、感菌株cyt 51基因的克隆及分析
参照NCBI数据库上的数据（gi: 18733977），葡萄炭疽病菌的cyp51基因序列，使用Primer Premier 5软件在基因的上下游100bp外设计引物，设计了一对引物CYP51-F/CYP51-R（CYP51-F: 5′-CCAACAGGGGTCAAAG-3’ / CYP51-R: 5′-GACGGACAGGGGGTAC-3′）可以扩增含有全部cyp51基因的片段。
运用引物143-F/143-R，以8株苯醚甲环唑抗性菌株及1株敏感菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增体系及反应程序如下。
扩增体系：
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（1 U/μL） 1 μL
2×Phanta Max Buffer 2.5 μL
dNTP mixture（10 mM of each） 1 μL
上游引物CYP51-F(10 μM) 2 μL
下游引物CYP51-R(10 μM) 2 μL
模板DNA（50 ng/μL） 1μL
ddH2O 18 μL
总体系 50 μL
扩增反应程序：95℃预变性3min；95 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸1.5 min，35个循环；72 ℃充分延伸5 min；4 ℃保存。
PCR扩增产物经琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化，送往上海生物工程技术服务有限公司进行测序。使用BioEdit软件对苯醚甲环唑抗、感菌株cyp51的碱基序列及其编码的氨基酸序列进行比对分析。本试验重复3次。
2 结果与分析
2.1感抗菌株对苯醚甲环唑的EC50测定
采用菌丝生长速率法测定了2016年从江苏镇江不同葡萄大棚采集分离的80株炭疽菌（Colletotrichum spp）单孢菌株对苯醚甲环唑的敏感性，建立敏感性基线1.9906±0.04494μg/ml，EC50值分布成单峰曲线（图1 注：本数据由马微微完成）。
从采集分离的80株炭疽菌单孢菌株中，挑取1株苯醚甲环唑敏感菌株及8株抗性菌株，采用菌丝生长速率法测定EC50（表1），结果表明：苯醚甲环唑敏感菌株与抗性菌株的EC50差别不大，说明炭疽菌对苯醚甲环唑的抗药性不明显。
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