平沙绿僵菌NJMP2103对东亚飞蝗的室内毒力测定(2)
真菌是最早被发现引起昆虫疾病的微生物，原因是它们生长在宿主的表面，明显可见，真菌也是首先被用作生物防治作用的微生物，并以其特殊的营养方式和独特的入侵方式和可靠的宿存机制在害虫的综合治理中表现出极大的生命力。昆虫病原真菌，即虫生真菌，是自然界控制害虫种群庞大的一类昆虫病原微生物，占所有昆虫病原微生物的60%，因此成为生物农药的主力军，其中绿僵菌由于具有易培养，易储藏，施用简便等优点，而且在土壤中的存活时间较长，用它防治地下害虫，不仅在防治期间效果明显，而且残效期长，所以利用绿僵菌来控制地下害虫危害的潜力很大。与化学农药相比，微生物杀虫剂用于防治害虫有如下许多优点：(l)微生物杀虫剂对害虫作用特异性强，极少杀伤害虫天敌和有益生物，不破坏生态平衡。(2)多种成分和因素发生作用，害虫不易产生抗药性。(3)对人畜安全，不污染环境，有利于改善人类生产生活环境。(4)生产原料主要为农副产品和副产物，便于就地取材生产和应用，便于农村推广等[4]。
真菌杀虫剂具有对环境友好、对人畜无害、对农产品无残留等优点，是首先被研制为成品的微生物，随着人们对绿色食品需求的增加和对人居生态环境的向往，开展利用真菌防治害虫的研究越来越受到学者的青睐。但由于实验室环境和农田森林环境有很大的差距，真菌防治害虫仍然不是植保界的主流，生物农药占整个农药系统的比例仅为 10%，化学农药在市场上依然占据主导地位。由于化学农药的长期不合理使用，特别是一些高毒高残留农药的使用，导致了非常严重的“3R”问题。为了可持续农业的发展和人类思想意识的转变，化学农药所带来的负面影响引起了人类的思考，寻找环境友好型杀虫剂是时代的必然要求，细菌、真菌、病毒和线虫等均已用于微生物农药的开发。其中真菌杀虫剂具有无残留、致病力强、效费比高、可持续发挥作用、易于大规模工业化生产等优点而成为生物防治研究的主角[5]
我们所研究的绿僵菌是最早用于防治农业害虫的真菌，是一种广谱的昆虫病原菌，也能寄生螨类，它可诱发昆虫产生绿僵病。绿僵菌杀虫作用是:依靠分生抱子接触虫体，在适宜环境下萌发，长出菌丝，穿过体壁，在虫体内大量繁殖，产生毒素，形成圆筒孢子，使害虫得病，经3-4d死亡，防治效果可与白僵菌媲美[6]，由于绿僵菌的致病力较强，防效好，对人畜和环境安全。随着高效绿僵菌野生菌株发现种类的增加，并且有些菌株获得了良好的田间防治效果，人们对绿僵菌实际应用的潜力期望很高。近年来随着电镜技术和分子技术的的广泛应用，对绿僵菌的生物学特性、对寄主的感染途径及致病机理等有了更进一步的研究，有些菌株已成功应用于农林害虫的防治，明确绿僵菌的感染机制和致病机理对害虫的防治起着重要的指导作用[7]。
1 材料与方法
1.1 供试菌株
平沙绿僵菌菌株NJMp2103从田间采集的有真菌侵染症状的金龟子幼虫尸体中分离获得。分离方法为将从田间获取的金龟子幼虫尸体于将表面清洗干净，用5%次氯酸钠溶液对其尸体表面进行4-5分钟的消毒，再用灭菌水洗净。为分离出所需的绿僵菌，将其尸体分离开并置于结晶紫培养基中，在25℃的恒温环境下连续培养7d。7d后虫体上已长出大量菌丝，挑取部分菌丝接入马铃薯葡萄糖平板培养基进行培养，培养产孢后分离出单个孢子。再将菌株接入PDA培养基中，在25℃的恒温环境下连续培养7d左右后使用[8]。
对分离出的菌株使用ITS4-ITS5引物对其进行PCR扩增，并获得其目的条带进行回收将回收的核酸送于南京金斯瑞公司进行测序，在NCBI上进行Blast序列比对后将菌株鉴定为平沙绿僵菌。