富氢水对玉米缺铁适应性的影响及其机理研究(3)
1.3 MDA和H2O2的测定
参照Han et al. (2008) 和 Jin et al. (2013) 的方法，通过测定硫代巴比妥酸活性物质(TBARS)的含量来判断膜脂过氧化的程度。取0.5 g叶片加入5mL 5%(w/v)TCA充分研磨，1,2000×g 离心15 min；取2 mL上清液，加入2 mL0.67% 硫代巴比妥酸(10%TCA配置)，加热至95℃反应30min，冰浴迅速结束反应，1,2000×g 离心10 min，分别在450 nm、532 nm、600 nm 测定反应液的吸收值，根据公式计算MDA含量：MDA(nmol g-1 FW) = [6.45×(A532-A600)]-[0.56×A450].
按照Velikova et al. (2000)的方法，测定对照叶片及铝胁迫处理后叶片中 H2O2 的含量。取0.2 g叶片加入2 mL0.1%(w/v)TCA，在冰盒上研磨成匀浆，12,000×g离心15 min；取0.5 mL上清液，加入0.5 mL 10 mM(pH7.0)磷酸缓冲液和 1 mL KI，完全反应后，在390 nm波长下测定反应液的紫外吸收值；再根据已知浓度的H2O2曲线计算出相应H2O2浓度。
1.4 SOD，CAT，APX，GR，POD抗氧化酶活性的测定
取0.5 g叶片液氮研磨，加入3 mL 50 mM(pH 7.0)磷酸缓冲液(含1mM EDTA 和1%聚乙烯吡咯烷酮)研磨成匀浆，在4℃条件下1,2000×g 离心20 min之后，取上清液用于各种酶活性的测定。
按照 Giannopolitis和Ries(1977)的方法，通过测定氮蓝四唑光化学还原的抑制程度来分析SOD的活性。其中3mL反应体系包括：50 nM(pH 7.8)磷酸缓冲液，13 mM甲硫氨酸，75nM NBT，2 nM核黄素，0.1 mM EDTA和100μL酶提取液；反应混合液在1000 µmol m-2s-1光强下照射15 min后结束反应。一个SOD活力单位以560 nm波长下，抑制 50% NBT光还原所需的酶量计算。
按照Aebi(1984)的方法，通过测定240 nm波长下3 min内H2O2的消耗量计算CAT(消光系数为39.4 mM-1cm-1)的活性，3 mL反应体系包括：50 mM(pH7.0)磷酸缓冲液，10 mM H2O2，100 µL酶提取液。
根据Nakano和Asada(1981)的方法，通过测定290 nm波长下3 min内反应体系紫外吸收值的下降计算APX(消光系数为2.8 mM-1cm-1)的活性，3 mL反应体系包括：50 mM(pH 7.0)磷酸缓冲液，0.5 mM ASC，0.1 mM H2O2，50 µL酶提取液。以添加酶提取液开始反应。
按照朱展才(1986)的方法，通过测定470 nm波长下3 min内吸光度变化值即愈创木酚的氧化程度计算 POD的活性，3 mL反应体系包括：100 mM(pH 5.4)醋酸缓冲液，0.25%愈创木酚，0.75% H2O2，10 µL 酶提取液。
按照Schaedle和Bassham(1977)的方法，通过测定340 nm波长下3 min内NADPH的氧化程度计算GR(消光系数为6.2 mM-1cm-1)的活性，3 mL反应体系包括：50 mM(pH 7.8)磷酸缓冲液，2 mM Na2EDTA，0.15mM NADPH，0.5mM GSSG,150 µL酶提取液，反应从加入NADPH开始。
1.5叶片光合气体交换参数的测定
天气晴朗时，在上午9：00-11:30利用便携式光合作用分析仪（Li-6400, Li-Cor，USA）测定第四叶光合气体交换参数，测定时采用红蓝光源叶室，设置光强为1800 µmol m-2s-1，叶室内温度设置为25℃，CO2浓度为400±10 µmol ml-1，空气相对湿度为70±5%。测定光合参数Pn（净光合速率），gs（气孔导度），Ci（胞间CO2浓度）和Tr（蒸腾速率）。
CO2响应曲线测定时的CO2浓度梯度设定为400、200、150、100、75、50、400、400、800、1200、1500、1800 µmol mol−1；光响应曲线测定时的光强梯度设定为 2000、1800、1200、800、400、200、100、50、20、0 µmolm-2 s-1；CO2响应曲线及光合响应曲线参照。光呼吸速率(Rd)，光补偿点(Lcp)，光饱和点(Lsp)，表观量子传递速率(AQE)，和最大净光合速率(Pmax) 被计算通过光响应模型曲线，一个非等轴双曲线。