四种外生菌根真菌对黑松吸收转运镉的影响(2)
植物修复作为一种环境友好型的新型修复技术，相比于传统的物理化学修复成本更低，并且不产生二次污染[5]，受到了越来越多的关注[6]。松树是一种先锋树种，能够生长于营养不足等环境恶劣的生态体系中[7]，因此可被用作植物修复植物。外生菌根（EM）是外生菌根真菌（EMF）与多种植物根尖形成的共生体[8]。研究表明，外生菌根真菌与植物共生后，提高了宿主植物对干旱胁迫的抗性[9]、缓解了盐胁迫对宿主植物的伤害[10]，并且在宿主植物抵抗虫害和/或病原侵染等方面起着积极的作用[11]。此外，也有研究表明接种外生菌根真菌提高了宿主对重金属的耐性[12-13]。
目前的研究大都是将菌根植物直接种植到人工合成或者自然的污染土壤中，通过与非菌根化植物对比来阐明外生菌根真菌对宿主植物吸收重金属的影响[14-15]。但是由于土壤因素以及菌根的特点（比如土壤理化性质的改变，或者菌丝对氧气的需求不同等），会导致试验过程中菌根化率的改变(比如菌根死亡，植物根系穿透菌套），所以不能完全区分是植物还是外生菌根真菌的作用导致宿主植物对重金属吸收的改变。在本实验中，我们设计了一种根袋，能够将植物根系和外生菌根外延菌丝分开，从而可避免植物根系的干扰，直接评估外生菌根真菌对宿主植物吸收转运重金属的影响。
本实验选择了4种外生菌根真菌，在纯培养条件下比较了它们对Cd的耐性。通过根袋试验，探究了接种外生菌根真菌对宿主黑松生长以及重金属Cd吸收转运的影响。
1 材料与方法
1.1 外生菌根真菌的Cd耐性
供试的4种外生菌根真菌为：紫蜡蘑（Laccaria amethystina, La）、彩色豆马勃（Pisolithus tinctorius, Pt）、土生空团菌（Cenococcum geophilum, Cg）、红蜡蘑（Laccaria laccata, Ll）。其中La、Pt、Ll为从野外采集的子实体上纯化保存的菌种，Cg是从其野外采集的菌根上分离纯化的。这4种菌种均保存于改良的MMN[16]固体培养基中，4℃冰箱中贮存。
实验时，将其从冰箱中取出，重新在MMN固体培养基中活化。准备添加有不同浓度的Cd的MMN固体培养基。分别用直径8 mm的无菌打孔器在4种EMF母板外延活性菌丝上打取菌斑，然后反扣接种到上述培养基中，4种菌的处理浓度分别为（LA: 0, 5, 10, 15, 30, 60 mg L-1; Ll和Pt: 0, 1, 5, 10, 15, 20 mg L-1; Cg: 0, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2 mg L-1），每种菌每种浓度5个重复，培养40天后利用十字交叉法测定菌斑直径，分别统计它们的Cd半抑制浓度（EC50）。
1.2 外生菌根黑松准备
供试宿主植物选择日本黑松（Pinus thunbergii Parl.），菌根化黑松合成基质为火山灰（采自云南腾冲）：蛭石=1:1（w/w），121 ℃高压蒸汽灭菌30 mim，连续灭菌2 d。日本黑松种子用30% H2O2表面消毒10-15 min后，去离子水冲洗干净后播种于上述灭菌基质中，共准备10盆。
分别准备4种外生菌根真菌的菌液，具体方法：配置MMN液体培养基，分装到150 mL洁净的三角瓶中，每瓶分装100 mL，115 ℃灭菌20 min。分别用直径8 mm的无菌打孔器在4种EMF母板外延活性菌丝上打取菌斑，然后接种到上述液体培养基中，25 ℃黑暗恒温摇床（150 rpm）中震荡培养30 d。
播种45 d后，分别浇灌菌液，每种菌液浇灌2盆，隔半个月浇灌一次，总共浇灌3次，此外留2盆黑松不浇灌菌液。播种后的第90 d随机选择黑松统计菌根化率，每种接菌处理各挑选45棵菌根化率高于90 %且生长状况一致的黑松，同样，准备45棵生长状况一致的未接菌黑松。
1.3 基质准备
试验用土壤为采自云南腾冲的火山灰，土壤风干后过10目筛，121 ℃高压蒸汽灭菌30 min，连续灭2 d后，自然风干，对应的土壤理化性质见表1，添加 CdCl2•5/2 H2O，形成0，30，75，150 mg kg-1的浓度梯度，干湿平衡4次后备用。