拟南芥Des1基因的克隆与酵母双杂载体构建(2)
本课题所采用的酵母双杂交系统最初是1989年由Fields和Song[8]创立的，用于检测蛋白之间的相互作用，其基于真核生物转录过程中依赖反式转录因子的特点而建立。在真核生物的转录过程中，转录因子通常由两个或两个以上功能独立的结构域组成，酵母中的GAL4转录因子就包括两个功能区域：DNA结合结构域（DNA binding domain, DNA-BD）和转录激活结构域（activation domain, AD）。DNA-BD负责结合上游激活序列（upstream activating sequence, UAS），AD则可招募转录复合物，只有两者在空间上靠近时才可重新表现GAL4转录因子活性，从而激活下游报道基因GAL转录表达。因为GAL4转录因子的两个组分可以人为地分离，分离时仍具备各自的功能但不能激活转录。因此我们将DNA-BD和已知蛋白质DES1（通常称为诱饵蛋白，bait）的编码基因结合构建融合表达载体，再将AD与拟南芥cDNA文库结合构建文库质粒，转化至酵母细胞后利用mating杂交手段，根据报道基因的表达情况在cDNA文库中筛选能与DES1相互作用的未知蛋白，最后测序得到结果[9]。现今基因编辑技术发展迅速，商品化质粒如pGBKT7只需将目的基因连接在正确位置即可，随后配合特定酵母菌株即可完成检测。该技术原理简单，操作方便，高效灵敏，真实准确，能够客观反映生物体内蛋白互作情况，因而被广泛使用[10]。
本课题着眼于利用酵母双杂交技术来筛选DES1的互作蛋白，首先通过NCBI查找Des1（AT5G28030）的基因序列，克隆酶切连接至融合表达载体pGBKT7，再转化至酵母细胞内进行杂交筛选，以期得到未知的DES1互作蛋白序列，对于明确DES1的作用方式和调控网络有重要意义。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 植物材料及其培养
实验所用拟南芥材料为Col-0型，种子均表面消毒20 min，灭菌蒸馏水清洗三次后点播于含有1 %蔗糖的1/2 MS固体培养基上（pH 5.8）。种子经4 °C春化2 d后转移至光照培养箱内，光强为120 μmol m–2 s–1、白天/黑夜光照时间和温度分别为16/8 hr，24/18 °C。生长一周后取样用于植物总RNA的提取。
1．1．2 菌株及质粒载体
大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y2Hgold为本实验室保存菌株；融合表达载体pGBKT7购于Novagen公司。
1．1．3 主要试剂
RNA提取试剂Trizol购于杭州博日科技有限公司；DNA分子量标准（DL2000）、Taq DNA聚合酶、dNTP、Mg2+、PCR buffer等试剂均购于南京金斯瑞生物科技有限公司；PCR引物由南京擎科生物科技有限公司合成；AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒购于Axygen公司（杭州）；T4连接酶、T4连接酶buffer、质粒抽提试剂盒、逆转录酶AMV和限制性内切酶EcoR I、BamH I均购于大连宝生物工程有限公司（TaKaRa）；其余普通试剂均购于南京寿德试验器材有限公司。
1．1．4 主要仪器设备
BS-223-S型天平（Sartorius），Eppendorf 5417R型冷冻离心机（Eppendorf），超净工作台（苏净集团苏州公司），DK-8D型电热恒温水槽（上海一恒科技有限公司），PGX-350C型光照培养箱（宁波海曙赛福实验仪器厂），2720型PCR仪（Applied Biosystems），NanoDrop 2000（Thermo），DYCP-31DN水平电泳槽，凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）。
1．2 实验方法
1．2．1 总RNA的提取
准备工作：0.2 %焦碳酸二乙酯（0.2 % DEPC）过夜处理所有总RNA提取过程中使用的EP管、枪头以及无菌水等，并进行高压蒸汽灭菌（121 kPa, 20 min），后烘干待用。提取步骤参照提取试剂Trizol使用说明书进行。
1、研磨与匀浆：取拟南芥叶片约0.2 g于研钵中，倒入适量液氮充分研磨呈粉末状（研钵需先用液氮预冷），迅速转移到洁净的1.5 mL EP管中，马上加入1 mL Trizol试剂，振荡混匀数次。室温放置15 min后，4 °C，12000 rpm离心10 min。