ath5等位基因在斑马鱼神经前体细胞不对称分裂过程中的转录激活状态(2)
2.1.1 斑马鱼鱼卵的收集、固定和脱水 8
2.1.2 样品包埋 8
2.1.3 冷冻切片 8
2.2 RNA-FISH 8
2.2.1 RNA-FISH探针制备 9
2.2.2 RNA-FISH探针杂交 10
2.2.3 杂交后洗涤和抗体孵育 11
2.2.4 TSA染色和DAPI染色 11
2.3 DNA-FISH 11
2.3.1 DNA-FISH探针杂交 11
2.3.2 杂交后洗涤和DAPI染色 13
2.4 DOUBLE-FISH和IMARIS软件对单个细胞进行三文重构 13
2.4.1 RNA-FISH部分 13
2.4.2 DNA-FISH部分 13
2.4.3 IMARIS软件对单个细胞进行三文重构 13
3 结果与分析 14
3.1 收集斑马鱼鱼卵用于冷冻切片 14
3.1.1 斑马鱼幼体发育示意图 14
3.2 RNA-FISH 14
3.2.1 RNA-FISH探针制备 14
3.2.2 RNA-FISH结果（冠状冷冻切片） 15
3.2.3 RNA-FISH结果（矢状冷冻切片） 16
3.3 DNA-FISH 16
3.3.1 DNA-FISH实验结果 16
3.4 Double-FISH 17
3.4.1 Double-FISH结果(冠状冷冻切片) 17
3.4.2 IMARIS软件对单个细胞进行三文重构 18
4 讨论 20
致谢 22
参考文献 24
ath5等位基因在斑马鱼神经前体细胞不对称分裂过程中的转录激活状态
绪论
视网膜基本结构
视网膜(retina)居于眼球壁的内层，呈透明薄膜状，是脊椎动物的视觉感官。视信息先在视网膜上形成视觉神经冲动，随后沿视路将视信息传递到视中枢形成视觉。视网膜由胚胎前脑两侧神经外胚层凸出的左右两个视泡发育而来，属于中枢神经系统[1]。在胚胎发生过程中，视网膜的发育先是由前脑神经外胚层外凸形成左右视泡，随后视泡内陷形成双层视杯结构，视杯内层的多能视网膜前体细胞(RPCs, Retinal Progenitor Cells)进而进行分化发育为组成成熟视网膜的6类神经元和1类胶质细胞。RPCs形成合适类型和数量的这7类视网膜细胞，正是构建功能性视觉环路的关键基础[2]。在不同种类的脊椎动物中，视网膜结构和发育过程具有保守性，不同的细胞类型按大致的时间顺序依次产生，视网膜神经节细胞(RGCs, retinal ganglion cells)最早产生，然后出现无长突细胞(ACs, amacrine cells)、水平细胞(HCs, horizontal cells)、视锥光感细胞(cone photoreceptors)、视柱光感细胞(rod photoreceptors)、双极细胞(BCs, bipolar cells)，最后产生Müller 胶质细胞(Müller glial cells)。这七种细胞相互联系构成了五层结构，由外向内依次为外核层、外网层、内核层、内网层和节细胞层。如绪论图1所示，PRs(photoreceptors)的胞体构成外核层，HCs、BCs和ACs的胞体构成内核层，RGCs和dACs（displaced amacrine cell）的胞体构成节细胞层，细胞之间的突触连接则构成了外网层和内网层[3]。
绪论图1：视网膜细胞组成结构图[2]
（注：ONL外核层，OPL外网层，INL内核层，IPL内网层，GCL节细胞层）
由上述可知，一方面，视网膜的组分相对简单、细胞种类较少，不同类型的细胞排列较为整齐；另一方面，视网膜有着中枢神经系统相一致的共性，例如，在视网膜中，神经元也处于神经胶质细胞及其突起的海洋中，血-视网膜屏障也与血-脑屏障具有同样的功能。因此视网膜作为中枢神经系统中相对简化的一部分，对于研究复杂难解的神经系统发育过程，有着无法比拟的优势，因而一直以来视网膜广受青睐，是研究神经系统发育很好的模型。本课题中的研究对象为斑马鱼(Danio rerio)幼鱼的视网膜。