褪黑素预处理对水稻耐盐性的影响(3)
1.2 试验设计
按种子发芽期和幼苗期两个阶段进行。种子发芽期：设置7个不同的处理，处理液如下：Control：去离子水培养；S120：120mMNaCl溶液培养；S120+MT10：120mMNaCl+10μM MT培养；S120+MT50：120mMNaCl+50μM MT培养；S120+MT100：120mMNaCl+100μM MT培养；S120+MT200：120mMNaCl+200μM MT培养；S120+MT500：120mMNaCl+500μM MT培养。每个培养皿加入15粒种子和10 mL处理液，每处理设3次重复，每隔2 d更换1次处理液，发芽第4或7 d后进行水稻发芽形态观察、拍照，并进行种子发芽势、发芽指数和活力指数等指标测定。幼苗期：用不同浓度（0, 25, 50, 75和100μM）MT溶液浸种、发芽、培育水稻幼苗至2叶1心期（每个处理重复3次，每个重复25株苗），用含120 mM NaCl的1/2木村B 营养液胁迫7 d后，进行水稻植株生长形态观察、拍照，并以75μM MT处理植株为代表进一步分析植株鲜重，根系活力，根和叶REL值、H2O2含量及CAT、SOD活性。
1.3 测定方法
1.3.1 种子发芽期
以芽鞘长达种子长度1/2为发芽标准，培养至第4或7 d时分别统计发芽势或发芽率。种子发芽指数（GI）= Σ（Gt/ Dt）（Gt: 在t 天正常发芽的种子数；Dt:发芽天数）。培养至第7 d时，每个培养皿随机选取发芽种子6粒用直尺进行芽长测定。种子活力指数(VI)= GI ×S（S:第7 d发芽水稻的芽长）。
1.3.2 幼苗期
1.3.2.1根系活力测定
采用TTC法，参照《植物生理生化实验原理和技术》(王学奎编，2006)。称取幼苗根尖0.5 g，放入10 ml试管中，加入0.4%氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液和磷酸缓冲液的混合液10 ml，把根充分浸没， 37℃下暗保温1 h，然后加入1 mol/L的硫酸2 ml，停止反应。把根取出，吸干水分后与乙酸乙酯3 ml和少量石英砂一起在研钵内研磨，提取三苯甲腙(TTF)。将红色提取液移入试管，并用乙酸乙酯将残渣冲洗2~3遍，然后一起移入试管中，最后加乙酸乙酯使总体积为10 ml，用分光光度计在485 nm下比色，用下述公式计算根系活力：根系活力(mg•g-1 FW•h-1)=C/(W×h)，其中C为四氮唑还原量，W为根重，h为反应时间。
1.3.2.2 相对电解质渗漏率测定
将新鲜的植物材料用去离子水冲洗干净，用吸水纸把水吸干。称取大豆幼苗根和叶片各1 g，剪成均匀小片，放入20 ml的试管中，加入15 ml的去离子水，室温下静置1 h，用玻璃棒轻轻搅动，然后用电导仪测溶液电导率(处理电解质渗漏率)。然后将呈有样品的试管放入水浴锅中，煮沸15 min，取出后冷却至室温，再用电导仪测溶液电导率(煮沸电解质渗漏率)。相对电解质渗漏率(%)=(处理电解质渗漏率/煮沸电解质渗漏率)×100%。
1.3.2.3 H2O2含量测定
H2O2含量的测定参照Gong et al[15]的方法.取新鲜叶片和根尖各0.2g，加入2ml 0.1 % (w/v) TCA 在冰浴上研磨成匀浆，4℃，12,000g 离心 15 min。取0.5ml上清液加入0.5ml 10mmol/L的磷酸缓冲液（pH7.0）和1mL 1mol/L的KI，混匀后测定390nm的吸光值，依据标准曲线测出H2O2的含量。
1.3.2.4 SOD和CAT活性测定
加入0.1mol/ L 磷酸缓冲液(pH 7.0) 100mL，20mmol/L EDTA•Na2 10mL和10%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，用去离子水定容至200 mL，,在冰浴条件下研磨成匀浆。将匀浆液全部转入至离心管中，于4℃，12000 g 离心15 min，收集上清液,测量提取液总体积,并低温保存备用。
CAT活性测定依据Hasanuzzaman et al. [16]方法，取1.5ml 0.1M PBS（pH7.0）,5μl 30% H2O2，1.445ml去离子水和50μL 酶液，测其1min内在240nm下，过氧化氢的降低值，消光系数为39.4M-1cm-1。
SOD活性测定采用NBT法 [17,18]。取1.5ml 0.1mol/L的PBS（pH7.8），0.3ml 130 mM Met，0.3ml 750 μM NBT, 0.3ml 20μM 核黄素，测其560nm的吸光值，按抑制蓝色形成的50%作为一个酶活力单位(U)。