水稻锌指蛋白ZFP207参与细胞分裂素途径的功能研究
毕业论文关键词：水稻；锌指蛋白；ZFP207；细胞分裂素途径
Preliminary Study on the Function of Rice Zinc Finger ProteinZFP207 in Cytokinin Pathway
Abstract： In this study, we investigated the preliminary function of zinc finger protein ZFP207 in cytokininpathway. ZFP207 is the TFⅢA-type zinc finger related to abiotic stress. The ZFP207 protein sequenceharbors a C2H2 type zinc finger domain with a plant-specific QALGGH conserved sequence. Theexpression of ZFP207 was negatively regulated by exogenous cytokinin in rice. Endogenous hormonecontent measurement showed that ZFP207 may be a negative regulator of cytokinin biosynthesis.Over-expression of ZFP207 in rice transgenic plants had less root dry weight and root length compared towild-type rice. The results of qRT-PCR showed that the gene expression of cell cycle related proteins wasincreased in ZFP207 transgenic rice. In summary, ZFP207 is a negative regulator of cytokinin pathwaylikely involved in the regulation of the growth and development of rice roots.Key words: rice；zinc finger protein；ZFP207；cytokinin pathway
目 录
摘要1
关键词1
Abstract.. 1
Key words.. 1
引言 ..1
1 材料与方法..2
1．1 材料及处理2
1．1．1 外源施加细胞分裂素时 ZFP207表达量变化趋势分析..2
1．1．2 内源细胞分裂素含量测定. 2
1．1．3 ZFP207转基因水稻表型鉴定... 2
1．1．4 ZFP207转基因水稻中细胞分裂素相关基因表达分析...2
1．2 水稻植株总 RNA 的提取 3
1．3 cDNA 第一链的合成... 3
1．4 Quantitative Real-time PCR 分析. 3
2 结果与分析..3
2．1 外源施加细胞分裂素对 ZFP207 表达的影响 ..3
2．2 水稻内源细胞分裂素含量测定... 4
2．3 ZFP207转基因水稻根部表型鉴定. 5
2．4 ZFP207转基因水稻中细胞分裂素相关基因表达分析.5
3 讨论..7
3．1 ZFP207是负向调控细胞分裂素的转录因子. 7
3．2 ZFP207 促进细胞周期相关蛋白基因的表达 7
致谢8
参考文献9
引言 水稻是重要的粮食作物之一，其形态建成与逆境响应的机理一直是研究工作者分析探讨的重点。水稻在受到非生物逆境胁迫时，体内发生了一系列从细胞到生理水平的反应。在这些反应过程中,主要有两类基因在起作用，一类是直接保护细胞免受逆境胁迫的功能蛋白以及渗透调节因子，另一类是参与胁迫信号传导和表达调控的蛋白激酶与转录因子。锌指蛋白是植物体内一类数量庞大的转录因子，根据其功能不同，可以分为 TFⅢA 型、WRKY、DOF、GATA、RING 和 PHD等亚家族。TFⅢA 型锌指蛋白的锌指结构域具有 CX2CX3FX3QALGGHX3H 的序列特征[1]。水稻中参与植物生长发育的TFⅢA 型锌指蛋白的研究报道不多。ZFP207 是植物中第一个报道的与逆境胁迫相关的TFⅢA型单锌指基因[2]。细胞分裂素是 N6-异戊烯腺嘌呤衍生物，其生物合成分为 tRNA 途径和从头合成途径，然而 tRNA 的代谢速率很低，对于形成植物体内大量的细胞分裂素是不够的,所以，tRNA 途径是次要的，从头合成途径是主要途径[3]。从头合成的途径有 AMP 途径、ATP/ADP 途径和旁路途径。细胞分裂素的信号传导通过双元组分系统实现。双元组分体系由组氨酸激酶和应答调节子（RR）两种蛋白质组成，大多数的组氨酸激酶是位于细胞外间隙的带有信号传感区的横跨膜受体（输入区）和位于细胞质的信号转导区（转运区） ，应答调节子具有接受区的特性[4]。细胞分裂素是一种常见的流动的植物类激素，对细胞的分裂增殖起着重要的调节作用,在细胞周期中的 G1/S 期，细胞分裂素促进D 型细胞周期蛋白 CycD 的表达；在 G2/M 期,其作用与 CDK 的磷酸化有关。植物通过体内细胞分裂素的代谢影响细胞分裂素水平,调节植物生长发育的调控基因， 影响植物根尖的生长发育[5]。外源细胞分裂素能促进拟南芥中 G1/S 期 CYCD3，G2/M 期 CYCBl、CDKA 等基因的表达[6]。在黑暗条件下生长的水稻幼苗中，cycD，cycHl，cycC，cycAl；1和cycB2；1 几个与细胞周期相关的基因的表达下调，但细胞分裂素 KIT (kinetin)处理后,能够阻止这些基因表达的下调[7]。另有研究细胞分裂素对水稻细胞周期关键调节基因表达的调节情况，结果显示 37 个基因的表达受细胞分裂素调节，其中，12 个基因表达上调，25 个基因表达下调，推测水稻细胞周期关键调节基因可能通过响应细胞分裂素来调控植物的细胞周期，进而调控其生长发育[8]。此外，细胞分裂素能够调节根部文管组织的生长发育，调节地上部和地下部的生长模式，影响营养的吸收和分配，调节根瘤的生长发育，延缓叶片衰老形成次生代谢组织等重要作用，调节植物的生长和发育过程[9]。本研究探索了 ZFP207 对外源细胞分裂素的响应模式，发现外源施加细胞分裂素后，根部 ZFP207 表达量有所下降。对 ZFP207 转基因植株内源细胞分裂素含量测定发现，过表达植株中细胞分裂素含量较野生型有明显降低，而在干涉抑制表达植株中则相反。对 ZFP207 过量表达转基因水稻根长及根干重进行了统计，发现其根长比野生型明显短且干重明显下降，说明 ZFP207过量表达后，抑制了植株根部的生长发育。通过对转基因植株根部的细胞周期相关基因表达量进行了检测，发现细胞周期相关基因在过量表达植株根部的表达量明显增高。综合已有结果，我们推测 ZFP207 可能通过细胞分裂素信号调节细胞周期相关蛋白基因的表达，进而调节水稻根部的生长发育。1 材料与方法1．1 材料及处理野生型、过量及干涉抑制表达 ZFP207 的粳稻（Oryza sativa L. subs. japanica）品种中花 11籽粒由本实验室提供。1.1.1 外源施加细胞分裂素时 ZFP207 表达量变化趋势分析 水稻中花 11 种子用0.1%的 HgCl 消毒 15min，37°C 催芽至水稻种子露白，然后将种子播于 96 孔板中，生长两周后，在培养液中分别加入 1μM 的细胞分裂素和纯水，于人工气候培养箱(16h 光照/8h 黑暗，白天 28°C，夜晚 23°C)中水培生长，营养液采用国际水稻所常规营养液配方。每个处理在 0 h、0.5h、1 h、3 h、6 h、12h、24h、48h时段取样，液氮速冻，用于细胞分裂素处理的基因表达分析。1.1.2 内源细胞分裂素含量测定 将 ZFP207 过量表达转基因水稻 OE1、ZFP207 干涉抑制表达转基因水稻 R10、中花 11 的种子培养至三叶期水稻幼苗时取样，分别按三株幼苗为一个混合样品，每个株系的混样准备两份，液氮速冻，-80℃保存。将样品用干冰保存寄往武汉绿剑可瑞信科技有限公司，通过高效液相色谱质谱法测定水稻幼苗内源细胞分裂素及其他酸性激素的含量，每个样品测定三次。1.1.3 ZFP207 转基因水稻表型鉴定 将野生型和过量表达 ZFP207 的水稻种子播于96 孔板中，培养至 20 天，测量根长，每个株系 10 个重复；每四株并一个混样，每株系三份混样，60℃烘 24h 后测根干重。1.1.4 ZFP207 转基因水稻中细胞分裂素相关基因表达分析 将野生型和过量表达ZFP207的水稻种子播于96孔塑料板中， 于人工气候培养箱(16h光照/8h黑暗， 白天28°C， 夜晚 23°C)中生长， 分别提取植株根部 RNA后合成 cDNA 第一链， 进行 QuantitativeReal-time PCR 分析。1．2 水稻植株总 RNA 的提取水稻植株总RNA的提取参照Invitrogen公司的Trizol法提取植物总RNA步骤完成：1）取水稻幼苗新鲜的根在液氮中迅速研磨样品至粉末，将大约 0.2g 样品转入预冷的去 RNA酶的 2mL Eppendorf 管中，向其中加入 1 mL Trizol 试剂，室温静置10 min；2）4℃，12,000 rpm离心 10min；3）取上清加入一新的事先预冷的去 RNA酶的 1.5mL Eppendorf 管中，加入0.2mL氯仿，0.2mL苯酚后，涡旋振荡混匀 15s，冰上静置 5min；4）4℃，12,000 rpm离心 10min；5）转移上层水相至一新去 RNA酶的 1.5mL Eppendorf 管中，加入 0.5mL 异丙醇，轻轻混匀，室温静置 5min；6）4℃，12,000 rpm离心 10min；7）弃上清用 75%乙醇洗涤沉淀，重复 1 次，空气中干燥 5min；8）加入 50µL RNase-free 水溶解 RNA；9） 总 RNA 的质量以及浓度通过1%琼脂糖凝胶电泳分析， 符合要求的总 RNA于-80°C保存备用。1．3 cDNA 第一链的合成cDNA 第一链的合成参照诺文赞公司反转录系统的操作手册进行：1) 在 32ul 体系中，加入 20ul RNase-free 水，8ul 4xgDNA wiper Mix，5ul RNA，混匀；2)于 42℃保温 2 分钟，往混液里加入 8ul 5xHiscript Ⅱ，混匀；3)将其放于 PCR仪中，设定 25℃，5min，10℃，1h，85℃，5min。1．4 Quantitative Real-time PCR 分析以水稻 18SrRNA 基因作为内部参照，设计基因特异引物（见表 1） ，按照 Roche 公司 Fast Start Universal SYBR Green Master （ROX） 操作说明进行实时荧光定量 PCR实验。实验结果采用 2-ΔΔCT法进行数据分析，计算公式如下：表达差异倍数=2﹣【 （样品目的基因 CT 值﹣样品内参基因 CT 值）-（对照目的基因CT 值﹣对照目的基因CT 值） 】[10]。