菊花热激转录因子CmHSF4A基因的克隆及其功能鉴定(2)
盐分胁迫时，植物细胞质膜受损，脂质的过氧化作用加速，胞内活性氧类物质迅速积累，超出细胞的清除能力，因此活性氧积累对细胞造成伤害，文持植物细胞区域化的膜系统被损伤甚至瓦解；活性氧与色氨酸残基或酶蛋白的巯基发生反应导致酶失活；活性氧破坏核酸结构，产生变异并积累；伤害DNA复制过程，蛋白质的合成被破坏[4]。此外，当植物在遭受盐等胁迫，其光合能力降低，光抑制发生，由此碳同化下降，光合电子传递链的过还原，过多的电子会因此而传给分子氧，导致氧气的单价还原或原子排序的异常，从而导致ROS的形成[5]。盐胁迫环境下诱导产生的活性氧引起膜质过氧化，为了减少盐胁迫下细胞的脂质损伤，植物在长期进化中，自身形成了一套活性氧清除系统。活性氧清除系统包括酶促防御系统和非酶促防御系统。酶促防御系统包括SOD、POD、CAT、APX、GR在内，这些保护酶活性的增强能够提高植物的耐盐能力[6]。SOD能够催化O2∙-转化成H2O2和O2，减轻氧化胁迫对细胞的伤害。非酶促防御系统主要由抗坏血酸AsA，GSH等直接与ROS发生反应。APX及CAT是清除H2O2的主要酶，在抗氧化胁迫过程中发挥着重要作用[7]。
形态解剖结构的变化也使得植物在进化过程中逐渐适应逆境并完成生活史，如表皮毛、乳状突起或腺毛等有利于防止蒸腾和排出盐分[8]。
此外，植物在盐胁迫下，土壤中离子浓度较高，植物细胞内部的水势高于胞外，从而导致细胞缺水。在不断进化的过程中，植物形成了渗透调节的生理机制，以增加细胞溶质浓度，降低胞内水势，文持细胞正常膨压，从而缓解由于脱水胁迫造成的伤害，提高植物的耐盐性[9]。无机渗透调节和有机渗透调节共同参与植物的渗透调节，无机渗透调节主要通过离子的选择性吸收和离子的区域化作用来调节体内的离子稳态，最终形成胞外、胞质、液泡三者之间的离子平衡[10]。但是，无机离子浓度过高会对细胞造成损伤，为了避免细胞质面临液泡和外部环境的双重压迫，因此，植物还会合成有机的亲和渗透调节物质来平衡细胞内外的渗透势，从而酶分子的构象和大分子物质的稳定得到文持[11]。细胞中合成的有机的亲和渗透调节物质主要有：氨基酸及其衍生物（如脯氨酸、甜菜碱等）、低分子糖类（如海藻糖、果聚糖等）、多元醇（如山梨醇、甘露醇等）。
植物热激转录因子（heat stress transcription factors）HSFs是存在于细胞内调节热激蛋白表达的一类转录调节基因，在植物热胁迫信号转导和耐热性的产生过程中发挥重要作用。当植物受到非生物胁迫如高温、干旱、低温和生物胁迫如昆虫取食、病原菌侵染，尤其是热胁迫（heat stress, HS） 时，植物会产生一系列的应激反应，热激转录因子被激活，通过基因活性的调节，对胁迫进行响应。然而在菊花中，关于HSF研究的报道相对较少，开展菊花相关HSF的克隆和功能鉴定对于菊花抗逆性分子机制解析及抗性分子奠定重要基础。
为此，本研究从菊花中克隆得到CmHSF4A，对其进行表达特性分析，初步明确菊花CmHSF4A转录因子的基本特征；另外对获得的超表达转基因株系进行盐胁迫鉴定，分析超表达CmHSF4A转基因植株的表型、生理变化及ROS水平，初步明确了CmHSFs参与菊花耐盐性的功能及调控机理。
1 材料与方法
1.1 植物材料、表达载体与菌株
用于CmHSF4A的克隆的供试菊花品种‘神马’来自南京农业大学“中国菊花种质资源保存中心”，采用农杆菌介导的叶盘侵染法转化的超表达CmHSF4A由张焕茹提供。本研究所用化学试剂均由Sigma公司提供。本实验室保存Gateway入门载体pENTR1ATM、亚细胞表达载体pMDC43、酵母单杂交载体pDEST-GBKT7和pCL1、大肠杆菌菌株DH5α、酵母菌株Y2H、农杆菌菌株EHA105等。TaKaRa公司和Invitrogen公司提供pMD19-T及各种工具酶类。