菊花‘神马’转基因阳性株系的筛选(2)
现已从拟南芥分离出的12个JAZ蛋白有两个保守区域，分别为ZIM结构域以及靠近JAZ蛋白C端的jas结构域 (Huang et al. 2009)。COI1依赖性信号通路通过抑制开花基因的表达可以延迟拟南芥的开花时间：APETALA2转录因子TOE1和TOE2与JAZ（茉莉酸-ZIM结构域）蛋白的亚型相互作用，并抑制FT的转录。当植物遇到胁迫条件时，具有生物活性的JA促进COI1依赖性JAZ的退化。JAZ阻遏蛋白的退化释放了TOE的转录功能以抑制FT的表达，从而触发信号级联以延迟开花。已有研究发现在拟南芥中超表达JAZ1ΔJas（即删除JAZ1中的一个结构域jas，然后将删除结构域的片段超表达），出现一个早花的表型(Zhai et al. 2015)。本研究希望通过克隆‘神马’中的JAZ1基因，并删除了相同的结构域，然后在‘神马’中超表达。观察是否存在与拟南芥中相同的表型，是否‘神马’中的这个基因与拟南芥中的基因功能相同。
1 材料与方法
1. 1 植物材料、表达载体和菌株
植物材料：由南京农业大学园艺学院花卉遗传育种与分子生物学实验室提供的菊花品种‘神马’无菌苗
表达载体与菌株：Gateway入门载体pENTR1A, 遗传转化表达载体pMDC32, 农杆菌菌株EHA105，大肠杆菌菌株DH5α均由本实验室保存
1. 2 菊花CmJAZ1基因的克隆
从‘神马’转录组库中获得该基因的开放阅读框（ORF）序列，设计全长验证引物(引物设计均采用Premier 5.0软件)，以cDNA为模板进行高保真全长验证，获得CmJAZ1的完整ORF序列。高保真酶反应体系与实验步骤如下：
(1) 反应体系：
5 × Phusion HF 10 μl
dNTPs Mixture (10 mM) 1.0μl
JAZ1-F 1.0μl
JAZ1-R 1.0μl
DMSO 1.5µl
cDNA 1.0μl
Phusion DNA Polymerase 0.5μl
ddH2O 34.0µl
Total 50.0µl
反应程序：98℃ 30 s; 98℃ 10s, 55℃ 30 s, 72℃ 30 s/1 kb, 35个循环；72℃ 7 min；4℃保温；
(2) 将高保真PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，选取特异性条带进行切胶、纯化；
(3) 将上述步骤2中的纯化片段进行加A尾，体系如下：
10×PCR Buffer 2.5 μl
Mg2+ (25 mM) 1.5 μl
dNTPs Mixture (2.5 mM) 2.0 μl
切胶、纯化片段 18 μl
rTaq (5 U/μl) 1.0 μl
Total 25 μl
混匀，离心，72℃保温30 min；
(4) 将步骤3中的加A尾产物再进行纯化，所使用的纯化试剂盒是：TaKaRa DNA Fragment Purification kit Ver.4.0。
(5) 将上述步骤4中的纯化产物进行连接、转化、测序。
1. 3 菊花表达载体构建
菊花表达载体构建采用GATEWAY技术进行载体构建，首先需构建入门载体pENTR1A。根据CmJAZ1基因开放阅读框序列(564bp)，将不含有末尾jas结构域的部分（1-348bp）构建到入门载体上，根据序列设计特异性引物JAZ1△jas-BamH I，JAZ1△jas-EcoR I（序列见表1），上下游引物各含有BamH I和EcoR I酶切位点。将目的基因ORF（564bp）中的前348bp通过BamH I和EcoR I限制性酶切位点与pENTR1A进行连接。以切花菊‘神马’材料cDNA为模板进行高保真PCR扩增，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，并切胶、纯化和回收。