孕穗期低温对小麦籽粒蛋白质及其组分含量的影响(3)
综上可见，前人对低温胁迫下小麦籽粒蛋白质含量的研究或仅针对低温水平对小麦蛋白质的影响，或仅针对低温持续时间对蛋白质的影响，较少考虑低温水平和低温持续时间的综合效应。再者，前人研究中关于温度的设置大都基于固定的白天/夜间处理温度，不符合自然温度的日变化规律。而在实际生产中，低温胁迫对小麦籽粒品质形成的影响，往往是温度日变化规律下低温水平和持续时间的综合效应。
因此，本研究通过在人工气候室中实施模拟的自然温度日变化规律下的小麦盆栽试验，研究孕穗期不同低温水平和低温持续时间对小麦籽粒中蛋白质及其组分含量的影响，同时利用ACDD定量分析孕穗期低温水平和低温持续时间对小麦籽粒中蛋白质及其组分含量的综合效应，以期为未来气候条件下小麦籽粒品质的提升提供理论依据和数据支持。
1 材料与方法
1．1 试验材料
采用春性品种扬麦16（V1）和半冬性品种徐麦30（V2）作为试验材料。
1．2 试验设计
试验于2015年11月——2016年6月在如皋市白蒲镇信息农业技术试验示范基地（32°16′N ,120°45′E）的人工气候室进行。人工气候室为阳光型智能人工气候室，由全透明玻璃小室组成，各个小室独立控制，每个小室长、宽、高分别为4.5m、3.0m、2.8m。人工气候室采用分段式温度控制方法，根据实际气温的日变化情况，每日12:00-15:00保持最高温，04:00-06:00保持最低温，其余时间段在最高温与最低温之间渐变，使人工气候室内温度曲线能够尽可能符合自然界实际温度的日变化模式。
实验于11月上旬播种，每桶播种25粒，三叶期留苗10株。桶直径30cm，高25cm，每桶装有8kg黄粘土，该土壤含全氮1.89g/kg，有效磷25.55mg/kg，速效钾98.32mg/kg。播前每桶施用基肥纯氮0.9g、磷肥（P2O5）0.5g和钾肥（K2O）0.9g，小麦拔节前追施纯氮0.9g 。其他管理措施如灌水、病虫害防治等同当地高产栽培管理措施，以确保小麦生长不受水分和病虫害等的限制。
生育前期小麦在正常环境下生长，进入孕穗期后（群体50%孕穗）移入人工气候室进行低温处理。实验共设置4个低温水平（T1（Tmin/max，6℃/16℃，对照）、T2（Tmin/max，-2℃/8℃）、T3（Tmin/max，-4℃/6℃）、T4（Tmin/max，-6℃/4℃））和3个低温持续时间（D1（2 d）、D2（4 d）、D3（6 d））。低温处理结束后，将小麦移除气候室，放入正常环境下继续生长，直至成熟。分别于花后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d和成熟期进行取样，用于测定小麦籽粒中蛋白质及其组分含量。
1．3 测试指标与方法
蛋白质含量测定采用半微量凯式定氮法，以含氮量乘以5.7计算籽粒蛋白质含量。
蛋白质组分采用连续提取法，其中：
清蛋白的提取：称取1 g样品于50 ml离心管中，加入10 ml蒸馏水，用涡旋仪涡旋混匀后放入震荡仪25℃下恒温震荡20 min，然后用离心机4000r/min离心5 min，取上清液倒入大消煮管，上述步骤重复3次。
球蛋白的提取：向提取过清蛋白的50 ml离心管中继续加入10 ml 10％的NaCl溶液，用涡旋仪涡旋混匀后放入震荡仪25℃下恒温震荡20 min，然后用离心机4000r/min离心5 min，取上清液倒入大消煮管，上述步骤重复3次。
醇溶蛋白的提取：向提取过球蛋白的50 ml离心管中继续加入10 ml 70％乙醇，用涡旋仪涡旋混匀后放入震荡仪25℃恒温震荡20 min，然后用离心机4000r/min离心5 min，取上清液倒入大消煮管，上述步骤重复3次。
谷蛋白的提取：向提取过醇溶蛋白的50 ml离心管中继续加入10 ml 0.2％的NaOH溶液，用涡旋仪涡旋混匀后放入震荡仪25℃恒温震荡20 min，然后用离心机4000r/min离心5 min，取上清液倒入大消煮管，上述步骤重复3次。