长三角地区蜻蜓目均翅亚目稚虫分类研究(2)
均翅亚目作为蜻蜓目下的一大亚目，其稚虫通常体细长，具尾腮。一般将稚虫的尾腮，单复眼，触角形状，下唇，前颏，下唇须叶等性状作为分类依据。目前国内对均翅亚目稚虫的研究较少，对稚虫的形态特征描述较少。
1.材料与方法
1.1研究标本
本研究所用标本来自作者及本实验室其他人员2016年在我国长三角地区十多个市，包括浙江省临安市、安吉市、金华市，江苏省各市，安徽省黄山市等地区的野外采集材料。采集到的成虫直接保存在三角纸袋中用于后续的分子实验，稚虫则带回实验室进行饲养，待养至末龄时置于无水乙醇中，-20℃保存。
1.2采集方法
1.2.1 成虫采集
成虫主要通过随机网捕获得[11]。根据蜻蜓主要栖息于水域附近地区的特点，在一些采样地点的溪流，湖泊，水塘或一些阴暗潮湿适合蜻蜓生长的区域进行采集[10]。
1.2.2稚虫采集
稚虫主要通过D型网采集。根据不同种类稚虫的习性不同，选择的采集地点不同。通常均翅亚目的稚虫多在水草丰盛的地方，溪流的边缘浅滩处可以找到[10]。用D型网从水草的根部向上捞或溪流浅滩处来回搅动寻找。有的稚虫喜欢沿石块上爬动，如溪蟌科稚虫，该类稚虫可通过将石块翻起查看表面获得。
1.3稚虫的饲养方法
目前稚虫的分类主要通过饲养的方法获得末龄稚虫，然后通过鉴定判断其种类。稚虫的饲养要尽可能的还原其原来的生活环境，例如在饲养罐中放置几块石子，或在底部铺上一层细沙。一个养虫罐只能饲养一头虫子，防止稚虫之间互相残杀。因均翅亚目稚虫个体较小，可用皮筋在养虫罐周边围一圈口径较小的尼龙布防止稚虫逃出。饲养池内水的深度通常为5-10cm，不宜超过15cm，以避免稚虫因水层过深供氧不足而窒息死亡[10]。饲养池内还需添加循环加氧泵，在冬季，调节养虫室的温度，一般保持在20℃左右即可。均翅亚目稚虫个体小，可喂食丰年虾。每天投放饵料一次，稚虫一般在上午十点和下午四点这两段时间内较活跃，善于捕捉猎物。因稚虫只吃活饵，故在喂食时，需用镊子夹住饵料来回摆动。平时饲养时需注意水中环境，及时清理稚虫排除的粪便和水中的杂物，平均3-4天换水一次。人工饲养的蜻蜓对水质要求较高，未经处理的自来水不宜直接使用，换水前应将自来水放入干净的桶内曝气24小时方可使用[10]。
将稚虫养至末龄时期即可放入无水乙醇中保存。若未及时将末龄稚虫保存，其羽化为成虫，则保存其蜕。完整的蜕保留了末龄稚虫的特征。
1.4研究方法
1.4.1标本观察与拍照
将稚虫置于培养皿中在Nikon SMZ800体视镜下观察其形态结构特征，根据检索表初步鉴定到属或种，之后利用Nis-ElementD®软件对幼虫进行拍照合成。最后后利用 Adobe Photoshop®对照片进行处理。
1.4.2分子生物学实验
1.4.2.1 DNA的提取
取稚虫和成虫的胸部肌肉，根据Ezup柱式动物基因DNA抽提步骤提取DNA，具体步骤如下：
⑴取均翅亚目稚虫的胸部肌肉加到灭过菌的1.5ml离心管中，加入180ulBuffer ACL，再加入20ulProteinase K溶液，震荡摇匀。56℃水浴3-5个小时至细胞完全裂解。
⑵加入200ul Buffer CL，充分颠倒摇匀。
⑶加入200ul的无水乙醇，充分颠倒摇匀。
⑷将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液和半透明纤文状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min，再10000rpm室温离心1min，倒掉收集管中的废液。
⑸将吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入500ul CW1 Solution，10000rpm离心30s，倒掉收集管中废液。
⑹将吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入500ul CW2 Solution，10000rpm离心30s，倒掉收集管中废液。