陆地棉SIZ1基因的电子克隆及其分析(2)
2.2.8雷蒙德氏棉Grsiz1b基因氨基酸序列 11
2.3陆地棉ESTs数据库中比对检索获得序列9条序列 11
2.4陆地棉5’端和3’端ESTs分别组装结果 12
3讨论 14
参考文献 16
致 谢 18
陆地棉SIZ1基因的电子克隆及其分析
引言
蛋白质翻译后修饰是基因表达调控的重要一环，包括磷酸化、乙酰化、甲基化、糖基化等。蛋白质翻译后修饰对改变蛋白功能、活性或定位都起着非常重要的作用 ，泛素及其相似蛋白的修饰是其中一种重要形式。SUMO化是在植物中新发现的，蛋白质翻译后通过小泛素类似物的修饰，命名为SUMO化，是在植物中新发现的一个蛋白质调控机制。在植物中，SUMO化在各种有机和无机胁迫反应中。最近工作就是用SUMO化缺陷的可育突变体显示了SUMO化在一系类发育过程中具有重要作用，例如：核质转运、细胞周期调控、信号转导、转录活性调控、细胞分裂、扩张、存活、分化、营养生长、生殖发育。这些观点将会总结在最近出现的有关于SUMO化在植物发育中的功能作用[1-2]。SUMO最早是在动物中发现的，相续在植物中的研究也较多,其在模式植物拟南芥中SUMO化修饰研究最多。
目前在拟南芥基因组中发现了3个编码SUMO连接酶的基因，而其中研究较多的是 SIZ1。拟SUMO连接酶3（AtSIZ1），SUMO是一个小肽，在植物生物或非生物反应中能调节蛋白质活性及调节激素信号。在这里展示的是在拟南芥中AtSIZ1调节氮同化是通过它SUMO连接酶3的功能。SIZ1 在植物的氮同化调节、交替呼吸的旁路、花期调控等生理过程、抗寒性、磷酸饥饿反应中都发挥着重要作用。此外，陆续在其他植物中对SIZ1研究较多，例如番茄、石桷兰、水稻、小麦等[3-7]。拟南芥siz1-2开花时间早，显示了不正常的种子发育和具有较高的水杨酸以满足跟提高抵抗细菌病原体。这些突变体的表型可以被恢复成野生型通过外源氨却不是硝酸盐，磷酸盐，或钾盐。在低氮的土壤，一氧化氮含量低和硝酸盐含量高的情况下，siz1-2植株跟野生型相比，硝酸还原酶的活性降低。这些硝酸还原酶（NIA1和NIA2）是被AtSIZ1 SUMO化的，AtSIZ1确实可以提高硝酸还原酶活性，SUMO化和非SUMO化的NIA1和NIA2都可以来自二聚体。实验结果表明在拟南芥中AtSIZ1确实可以控制氮同化通过促进nRs（硝酸还原酶）的SUMO化[8]。拟南芥SIZ1正向调控交替呼吸的旁路途径，植物线粒体具有交替呼吸途径它的调控是通过类型 II NAD(P)H脱氢酶和交替氧化酶（AOX）,这里研究的是拟南芥SUMO连接酶3（AtSIZ1）具有调节交替呼吸途径和参与碳氮平衡。大量类型 II NAD(P)H脱氢酶（NDA2和NDB2）和交替氧化酶（AOX1a 和AOX1d）基因的转录产物在拟南芥siz1-2突变体中要比野生型低。在野生型和Siz1-2突变型中过量的硝酸盐或铵盐都会降低或提高同一基因家族的表达。siz1-2突变体中游离糖（葡萄糖，果糖，蔗糖）的含量比野生型低。这些结果表明硝酸还原酶活性低是由于siz1-2突变体是相应降低了交替呼吸和保持低的碳水化合物含量文持碳氮比[9]。FLC(拟南芥春化作用相关基因)调控开花的抑制作用是通过SUMO化得以调节，FLC是开花植物的抑制因子，它是植物有营养生长转向生育生长阶段的关键因子。这里研究的是调控FLC蛋白活性和稳定的机制，利用双分子荧光互补和体外拉下实验分析表明了FLC与SUMO连接酶3（AtSIZ1）相互作用，并且表明AtSIZ1是FLC的SUMO连接酶3。在试管里SUMO化的实验显示FLC的调控是通过SUMO的参与，包括SUMO激酶1、SUMO结合酶2，但是FLC的SUMO化是通过AtSIZ1控制。在转基因植物中显示诱导AtSIZ1超表达会导致FLC的含量提高和延迟FLC蛋白翻译后修饰的衰退，还显示了AtSIZ1稳定FLC是通过其直接结合。然而，突变型FLC超表达植物的开花时间较野生型明显延迟，支持了这个观点SUMO化对FLC的功能是一个重要的机制。这些数据表明了FLC的SUMO化在控制植物的开花时间具有关键性的作用，还表明了AtSIZ1确实控制FLC调节的开花的抑制[10]。开花时间是通过SUMO连接酶（AtSIZ1）调控的，开花是植物的一个发育过程，这个过程受到化学跟环境刺激的影响。最近研究确定拟南芥SUMO连接酶3（ AtSIZ1）是一个促进开花的负调控因子，其机制是减少水杨酸积累和包括FLC的SUMO化。FLD是开花的抑制因子，它具有抑制FLC表达的自主途径。这个假设机制是SIZ1调控的SUMO结合酶和调节SA积累与FLD活性[11]。SUMO连接酶3（ AtSIZ1）通过控制SA的含量和影响FLC的核染色体结构调控开花植物的开花。缺乏SIZ1功能的突变体会导致早短数天开花，。SIZ1植物可以提高SA水平，这样可以被恢复成野生型通过表达nahG（细菌水杨酸羟化酶基因）。Siz1的早期开花被nahG的表达所抑制,这表明在短期内siz1主要通过抑制SA依赖花促进信号来抑制开花。先前的实验结果表明外源SA处理不能抑制自主途径的延迟开花，然而SIZ1突变体加速开花时间是一个自主途径，通过减少FLC的表达，FLC是开花的抑制因子。实验证明SIZ1需要完全调控FLC表达，在存在晚开花FRIGIDA（FLC的激活因子）情况下。有趣的是，提高FLC的表达晚开花植物的另一个突变自主途径FLD的表达没有被抑制，这表明了SIZ1促进FLC的表达是通过抑制FLD。与此相似，SIZ1促进FLD类泛素化，其在FLD的三个预测泛素化位点的突变中被抑制（如FLDK3R0。此外,FLD原生质体中FLDK3R的表达与FLD表达相比其大量降低FLC的转录，这一效应与FLC染色质中组蛋白4的乙酰化作用相关.综上，这些结果显示SIZ1是开花的抑制者，这不仅抑制SA的生成途径，还促进FLC的表达通过SUMO化抑制FLD的活性[12]。拟南芥ICE1的SIZ1调控的SUMO化控制CBF3/DREB1A表达跟植株的耐冻性。SIZ1是一种SUMO连接酶3，它可以促进SUMO结合蛋白质底物。siz1-2 和siz1-3 T-DNA插入等位基因后会导致SIZ1表达促使冷冻盒冷却敏感补充基因表达，表明了SIZ1是植物适应低温的控制者。低温诱导CBF/DREB1尤其CBF3/DREB1A的表达，这些调节因子SIZ1抑制。SIZ1不影响ICE1表达，ICE1编码一个MYC转录因子是CBF3/DREB1A的调控者。在试管中和原生质中用A K393R代替ICEI中的[ICE1(K393R)]中断SIZ1调控的SUMO化，因此确认了K393残基是SUMO化得主要结合点。试管中的SUMO化重组体减少蛋白质泛素化。在野生型植株中ICE1(K393R)表达体抑制了低温诱导的CBF3/DREB1A表达和提高了冷冻敏感性。此外，ICE1(K393R)表达诱导MYB15转录，它编码一个MYB转录子是CBF/DREB1.的负调控者。SIZ1依赖性的SUMO化的ICE1可以激活或稳定蛋白质是通过促进CBF3/DREB1A表达和抑制MYB15，从而导致低温耐受[13]。拟南芥SUMO连接酶3（AtSIZ1）控制磷酸缺陷反应，植物感应磷（Pi）缺陷和发送信号从而控制获得Pi的必须适应反应。实验结果表明AtSIZ1是一种植物的SUMO连接酶3和一种Pi饥饿反应的控制因子。T-DNA插入突变等位基因AtSIZ1 (At5g60410)导致拟南芥扩大了Pi饥饿反应模型，包括终止根的初生长、扩大根外侧和根毛的生长，提高根集流比率和大量花青素积累，甚至提高细胞内Pi水平，但是在SIZ1植株中这些反应都较野生型小。AtSIZ1在试管中具有SUMO连接酶3的活性，酶联分析显示在SIZ1植株中蛋白质外型被损坏。AtSIZ1-GFP被定位在细胞核浆中，大量的稳态转录物Pi饥饿反应基因AtPT2,AtPS2, 和AtPS3被稳定，但是明确显示SIZ1植株跟野生型比，Pi更充足。Pi饥饿诱导这些基因相同程度的表达在SIZ1和野生型植株中，然而另外两个Pi饥饿反应基因AtIPS1和AtRNS1，在Pi缺乏情况下要被诱导表达慢些在SIZ1植株中。PHR1是一个AtIPS1和AtRNS1的MYB转录激活剂，它是一个AtSIZ1介导的SUMO化靶点。这些结果表明AtSIZ1是一种SUMO连接酶3，并且SUMO化是一个调控机制，这个机制可以负调控跟正调控不同的Pi饥饿反应[14]。植物蛋白PIAS的PHD结构域和蛋白GTE结构域调节蛋白SUMO化，它是通过蛋白质共价结合调节SUMO化的许多过程在真核细胞中。在大多数情况下SUMO化是通过激活STAT蛋白而抑制蛋白活性得以协助，它的过程特征是SP-RING结构域连接很多泛素连接酶3的RING指域。这些SP-RING的重要性是基于具有结合酶2途径的功能。额外结构域可能参与SUMO连接功能和靶点筛选。该实验研究的是拟南芥SUMO连接酶（AtSIZ1）属于PIAS家族，它具有自SUMO化和AtSIZ1调控酶2（AtSCE1和GTE3），是通过一个结构域蛋白与AtSIZ1相互作用得以调控。在试管中GTE3修饰调节是具有结合乙酰组蛋白H3的功能，有趣的是AtSIZ1像其它植物PIAS蛋白一样也包含了一个PHD结构域。通过实验发现PHD域结合AtSCE1有助于SUMO连接功能，但是必须要AtSCE1和GTE3分别SUMO化。在AtSCE1和GTE3具有协助PHD和SP-RING域的基础下，建议构建一个相互作用的模型去解释GTE3的AtSIZ1调节的SUMO化和PHD结构域的连接功能[15]。