利用CRISPR技术敲除蒺藜苜蓿RIC8基因的初步研究(2)
根癌农杆菌是普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌，它可以趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，从而引起植物的根瘤病害。到目前为止，利用农杆菌侵染并通过组织培养方法的蒺藜苜蓿遗传转化工作有五种生态型的成功案例，它们分别是蒺藜苜蓿 R108、蒺藜苜蓿Jemalong 2HA、蒺藜苜蓿Jemalong J5、蒺藜苜蓿Jemalong A17和蒺藜苜蓿Jemalong M9-10a。因为蒺藜苜蓿生态型Jemalong A17具备优秀再生力，所以它是五个生态型中首先被用于研究蒺藜苜蓿与根瘤菌共生关系的模式植物。但是利用组织培养的方法对Jemalong A17蒺藜苜蓿进行遗传转化研究难度较大，因为Jemalong A17蒺藜苜蓿基因组序列是由单种子发育成的后代测序才得到的。相反的，蒺藜苜蓿R108生态型因为具有基因组小、种子产量大和种子成熟时间短等特点，所以常被用于研究相关的分子遗传过程。以蒺藜苜蓿生态型Jemalong和R108作为研究对象，可对豆科植物与根瘤菌共生互作的分子遗传机理进行深入研究。蒺藜苜蓿外植体的选择是遗传转化成功与否的关键。到目前为止，常用的外植体有叶片、子叶、花、根等。
1．2 根毛参与豆科植物与根瘤菌的共生固氮过程
1．2．1 根毛的生长模式
根毛是根的表皮细胞向外突起形成的管状结构，是吸收水分和营养物质的关键部位。根毛这种长管状结构使植物根部与土壤有更大的接触面积，大大促进了植物对土壤中养分和水的吸收利用效率。根毛具备培养周期较短，便于细胞学观察等优点，同时又与根瘤菌存在互作关系，而成为优良的研究系统[2]。
根毛的发育可以分成四个阶段：第一阶段是表皮细胞特异化突起位点的选择；第二阶段是根毛发生和突起的形成；第三阶段是顶端生长；第四阶段是根毛的成熟。
根毛的极性生长分为两个过程：根毛的发生和延伸。根毛发生过程是根表皮细胞产生生长点并凸起的过程，起始位置相对固定。拟南芥的根毛的发生部位在生根细胞的下部，靠近根尖的方向。对根毛的发生机理进行研究发现根毛的发生受到一系列因素的调控，包括植物体内的调控因子以及各种环境信号因子。在根毛的发生过程中，与极性相关的蛋白会富集在起始部位，例如小G蛋白ROP、与囊泡运输过程相关的调控蛋白、与细胞壁松弛过程相关的酶类等。
根毛的快速生长过程也由一系列的细胞活动协调完成，包括根毛起始涉及到的囊泡运输、Ca2+浓度梯度变化、细胞骨架的动态变化、小G蛋白ROP定位的改变等。
1．2．2 根毛的变形过程
根毛感染的过程和靠近根尖处易感根区根毛的顶端极性生长有紧密的联系。根毛变形或根毛卷曲表现为根瘤菌侵染区域的根毛显示出生长上的改变。根瘤菌与豆科植物的共生固氮的建立取决于细菌通过根毛感染宿主根的能力。许多豆科植物进化出顺应根瘤菌侵染的构造以便于充分地与根瘤菌联合，这个结构就是侵染线。侵染线是从根毛发生的管状结构，经过根毛细胞壁的沉积作用而延长，并通过根皮层加入到由中柱鞘发育形成的根瘤原基中。侵染线的发生经历连续的多个阶段：根瘤菌首先吸附在根毛上，然后导致根毛的变形或卷曲，随后根瘤菌在已经变形根毛的顶端增殖，并分泌出细胞壁降解酶穿透并进入根毛质膜。侵染线在根毛中形成之后，根的皮层细胞开始分裂，并发育成根瘤分生组织。