木质素酶产生真菌的分离纯化及鉴定(3)
图1 木质纤文素原料预处理目的
Fig.1 The goal of pretreatment on lignocellulosic material
自然界中，动物是不能够对木质素进行有效分解的，木质素的分解任务的主要承担着是微生物，包括真菌，细菌与放线菌，其中起主导作用的是真菌，细菌与真菌则起到了辅助作用。目前研究热点的是真菌，包括白腐真菌、褐腐菌和软腐菌。姜明国、黎海菲等筛选的Bax菌株，经过15d的培养，Bax木质素培养基中的木质素从560mg/L降解为29 mg/L，降解率48.21%;对造纸污水培养基中的木质素从210mg/L降解到135mg/L，降解率为35.71%[2]。
近年来随着科学技术的飞速发展，生物预处理由于其独特的优势取得了很大程度的发展，但是在生产的过程中依然存在着一些不足。主要是微生物的生长周期长，对温度较敏感，微生物在适宜的温度下生长较快，温度过高或过低均抑制其生长，pH值对微生物的生长也有很大的影响，如白腐真菌在微酸性环境中菌体生长良好，且可较快产酶并且产酶量大，随着后期pH值的不断升高，菌体生长和酶的产量均受到抑制，酶活也相对降低。同时相对物理和化学预处理，微生物预处理时间较长，效率较低。目前研究的重点在于筛选可以简捷、快速、高效降解木质素的微生物。
本文主要利用定性与定量的方法筛选具有木质素降解能力的真菌，从腐木和树皮分离出真菌，并用PDA-愈创木酚与PDA-苯胺蓝培养基进行筛选，并对选择得到的真菌进行酶活的测定，同时进行了显微特征观察和ITS鉴定。本研究对农作物秸秆利用、环境保护、我国生态农业的可持续发展有着重要意义。
1实验材料与方法
1.1样本来源
从校园足球场、玉泉河两旁树木、后山丛林等地点采集腐木与树皮经过分离后得到真菌。
1.2主要仪器
酶标仪；培养箱；高压灭菌锅；摇床；离心机；20μL、200μL和1000μL移液枪；无菌操作台；容量品；酒精灯；打孔器；培养皿；取样铲；接种针；电子天平；倒置显微镜；秸秆粉碎机；干燥箱；pH试纸；电泳仪；PCR扩增仪；电磁炉；微波炉；塑料培养皿；玻璃培养皿；2mL离心管；冰箱；三角瓶等。
1.3试剂配制
1.3.1柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液(0.125 mol/L, pH值3.0 )
配O.l25mol/L的柠檬酸和柠檬酸钠溶液各500mL，然后分别取出适量混合均匀调至pH值为3.0。
1.3.2醋酸缓冲液(0.05mol/L, pH值4.5 )
分别配制500mL浓度为0.05mol/L的醋酸和醋酸钠溶液，然后分别取出一定量混合均匀至pH值为4.5。
1.3.3 天青B(Azure B) 溶液(0.160mmol/L)
称量0.0489g天青B，用蒸馏水定容至1L。（分子量：305.83g/mol）
1.3.4双氧水溶液（2mmol/L, 500mL）
取102μL30%双氧水，用蒸馏水定容至500mL。（双氧水分子量：34g/mol, 30%双氧水密度：1.11g/mL）
1.3.5愈创木酚（40mmol/L, 500mL）
取2.22mL愈创木酚，用95%乙醇定容至500mL。（愈创木酚分子量：124.14g/mol,愈创木酚密度：1.12g/mL）
1.4 培养基
1.4.1菌种纯化培养基（PDA培养基）
配方：土豆200g,葡萄糖200g,琼脂200g,水1L，自然pH。方法：将土豆切成块，蒸馏水煮沸20—30min；然后八层纱布过滤，弃掉滤渣，得滤液；加入20g葡萄糖溶解，搅拌均均；补蒸馏水至1L；然后分装锥形瓶，根据比例分装琼脂条，加塞；121℃灭菌20min,冷却后贮存备用[6]。
1.4.2真菌分离培养基
PDA固体培养基溶化后+过滤灭菌青霉素（20—100μg/mL），要等培养基基本不烫手时再加入。