氰戊菊酯降解菌的选育及鉴定(2)
1.材料与方法
1.1试验材料
1.1.1试供土壤
来自周口市川汇区附近实施过农药的农田及果园土样，共5份土样
1.1.2试验试剂
20%氰戊菊酯乳油，NH4NO3 ，(NH4)2SO4 ，KH2PO4，K2HPO4，MgSO4•7H2O，NaCl，蛋白胨，酵母膏，明胶，蒸馏水，琼脂粉，1.6％溴甲酚紫乙醇液，葡萄糖，果糖，麦芽糖，乳糖，甘露醇，蔗糖，吲哚试剂，路哥氏碘液，3%-5%过氧化氢，ɑ-萘酚，甲基红，牛肉膏，40%NaOH，柠檬酸钠，NH3H2PO4，1%苯酚红，贝立脱试剂
1.1.3实验仪器
表1 主要仪器一览表
仪器名称 型号 生产厂商
电子天平 AR124CN 上海奥豪仪器有限公司
精达恒温培养摇床 ZHWY-2102 金坛市精达仪器制造有限公司
万用电炉 DL-1 北京中兴伟业仪器有限公司
生化培养箱 LRH系列 上海一恒科技有限公司
荣声冰箱 BCDR23 广东省顺德市荣贵区荣贵路
洁净工作台 SW-CJ-2FD 上海博迅实业有限公司医疗设备厂
立式压力蒸汽灭菌器 LDZX-50KB 上海中安医疗器械厂
中佳高速离心机 HC-3018 安徽中科中佳科学仪器有限公司
普析紫外分光光度计 TU-1810 北京普析通用仪器有限责任公司
1.2试验方法
1.2.1培养基
无机盐培养基（500 ml）：NH4NO3 0.5 g，(NH4)2SO4 0.25g，KH2PO4 0.25 g，K2HPO4 0.75 g，MgSO4•7H2O 0.25 g，NaCl 0.25 g ，蒸馏水500 ml，pH值7.0【1】；
LB液体培养基（500 ml）：蛋白胨 5 g，酵母膏 2.5 g，NaCl 5 g，蒸馏水500 ml，pH值7.0（固体加1.8%的琼脂，均在121℃高压灭菌20 min）【1】；
葡萄糖蛋白胨水培养基：葡萄糖 0.5 g，蛋白胨0.5 g，K2HPO4 0.5 g，蒸馏水100 ml【5】；
明胶试验培养基：明胶 12 g， NaCl 0.5 g，蛋白胨0.5 g ,调pH7.2-7.4蒸馏水100 ml，琼脂粉2.0 g【6】；
糖类发酵试验培养基：蛋白胨1.0 g， NaCl O.5 g，1．6％溴甲酚紫乙醇液0.2 ml，pH 7.5，蒸馏水100 ml，另配20％糖溶液各1 ml，分装试管【5】；
吲哚试验培养基：蛋白胨0.2 g，葡萄糖0.5 g，KH2P04 0.3 g，蒸馏水100 ml，然后分装试管，每管4—5 cm；吲哚试剂：对二甲基氨基苯甲醛1.00 g，乙醇(95％)95 ml，浓盐酸20 m1【4】；
柠檬酸盐培养基：柠檬酸钠 0.2 g，K2HPO4 0.1 g，NH3H2PO4 0.1 g, NaCl 0.5 g,MgSO4 0.02 g,琼脂0.2 g,蒸馏水100 ml，1%溴麝香草酚蓝1 ml【4】。
1.2.2菌种的筛选及纯化
菌种的筛选： 从采集到的5份土壤样品中每份各称取5g土壤，分别加入到含50 mg/L氰戊菊酯100mL的无机盐培养基中，然后将培养液放入30℃、120 r/min的恒温培养摇床中震荡培养72 h；待菌长出后按5%的接种量接种到同样的无机盐培养基中，传代过程中氰戊菊酯的浓度增大至200 mg/L，同样30℃、120 r/min震荡培养72 h；再次传代，同样取5%的继代培养液接种到同样的无机盐培养基中，氰戊菊酯农药浓度增至500 mg/L，30℃、120 r/min震荡培养72 h。
菌种的纯化：摇瓶培养结束后，将分离出来的5份农药降解菌用平板划线法接种到LB固体培养基上并分别做一组平行对照，放入37℃恒温培养箱中培养48 h后发现有4份长出菌株，有一份培养液没有任何菌株生成。把这4份菌株分别命名为QBY01、QBY02、QBY03、QBY04。将筛选出的4份菌株取单个菌落各一环分别接种到100 mL液体 LB液体培养基中，30℃，120 r/min震荡培养增殖。24 h后发现3份LB培养液变浑浊（QBY01、QBY03、QBY04），有一份未变浑浊（QBY02）；把3份浑浊的增殖后培养液做10^-1到10^-10的浓度梯度稀释，分别取10^-5到10^-10浓度阶段的菌悬液200 uL均匀涂布到LB固体培养基上并各做一组平行对照，放在37℃的恒温培养箱中培养48 h。待菌落长出后，取长势好的单菌落做斜面保存于4℃冰箱中保存菌种。
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