人AAVS1位点的TALENS质粒构建及活性验证(2)
3.4阳性克隆测序结果分析 - 15 -
3.5．活性验证结果 - 17 -
4 结论 - 19 -
5 心得与展望 - 20 -
5.1 心得 - 20 -
5.2展望 - 21 -
致谢 - 22 -
参考文献 - 23 -
1 绪论
1.1 本课题的国内外研究进展
1.1.1 TALENS
1.2 AAVS1 位点
1.2 本课题的研究内容、目的及意义
1.2.1 TALENS
TALENS技术是其利用TALEs蛋白核酸结合域氨基酸序列与其靶位点核酸序列之间存在着恒定对应关系，从而组装出能特异性结合任意DNA序列的模块化蛋白。TALENs技术操作简便，理论上可以定向修饰任意内源基因序列。克服了传统诱变方法的盲目性和偶然性，可以定点、定量地改造生物体基因组结构，修饰后基因会随染色体DNA复制，便于后续研究。现阶段对于TALENS的研究有三个方面。
(1)TALEN的基因敲除：将识别特异DNA序列的TALE与内切核酸酶FokI偶联,可构建成剪切特异DNA序列的内切酶TALEN。而且FokI需形成2聚体方能发挥活性，大大减 少了随意剪切的几率。在实际操作中，需在目标基因的编码区或外显子和内显子的交界处选择两处相邻（间隔13-22碱基）的靶序列（一般16-20个碱基） 分别进行TAL识别模块构建。 将这两个相邻靶点识别模块（分别）融合克隆到FokI的N-末端，形成真核表达载体，得到TALEN质粒对。将TALEN质粒对共转入细胞中可实现靶基因敲除。TALEN质粒对共转入细胞后，表达的融合蛋白，分别与靶位点特异结合， 由于两个TALEN融合蛋白中的FokI临近， 形成二 聚体，发挥非特异性内切酶活性，在两个靶位点之间剪切DNA， 形成DSB（Double-Strand Breaks）,诱发DNA损伤修复机制。细胞可以通过NHEJ（Non-homologous End Joining）修复DNA， 在此修过程中或多或少地删除或插入了一定数目的碱基，造成移码，形成目标基因敲除突变体。
(2) TALEN的同源重组:当通过TALEN产生DSB后，若能提供同源修复模板，细胞可通过同源重组方式修复DNA，因此可以对内源DNA做更精细的操作， 如点突变（磷酸化位点）、保守区域替换、 N端或C端加标记（GFP、HA、Flag…）等等。通过TALEN产生DSB后，在外源模板存在的情况下，发生同源重组修复DNA 。
(3)TALEN的转录激活:将识别特异 DNA序列的TALE与转录因子激活区域VP64(VP64 Activation Domain )融合，可构建成识别启动子上特异DNA序列 的转录激活因子TALEA. 在实际操作中，需在目标基因的启动子上游选取靶序列（一般12-18个碱基），构建TAL识别模块。 将识别模块TALE融合克隆到VP64的N-末端，形成真核表达质粒TALEA。将TALEN质粒转入细胞中， 表达的融合蛋白结合启动子附近的特异DNA序列， 并通过VP64激活区域与Pol II 结合，从而激活基因的转录，提高了内源目标基因的表达。
除了TALENS 技术介导的基因组定点突变技术之外，TALE无疑还可以应用于对基因组进行其他的操作调节。已有报道将TALE的DNA结合结构域与其他蛋白的转录激活结构域(例如VP16或VP16的四聚衍生物VP64)或转录抑制结构域融合，可分别激活或抑制靶基因的转录表达。不难预见，TALE还应该可以与甲基化结构域等其他功能结构域融合，从而实现甲基化基因组上的特定位点、研究表明遗传调控等等对基因组的其他定点操作。不过，通过用户定制的TALEN随意改造复杂的基因组，依然是TALE 应用中最为吸引人的。毋庸置疑，TALEN技术对基础研究、生物技术和人类基因治疗等诸多领域都会产生重大影响，堪称基因组定点修饰技术的一场革命。它开辟了前所未有的方式来剖析任意物种的基因功能，还可以在同一个细胞系上利用TALEN 技术产生不同的遗传病模型，为人类遗传病或后天的基因紊乱疾病开启了新的治疗途径。
下一篇：花铃期增温对棉籽品质形成的影响