利用CRISPR/Cas9系统获得水稻ddm1突变体及其表型研究(3)
同时，我们利用获得的突变体与野生型日本晴进行杂交，在后代可获得表观遗传重组自交系，从而研究与水稻重要农业性状相关的基因。
1 材料与方法1.1 水稻背景材料本实验研究所用的遗传转化的受体材料为日本晴，属粳亚种。 在国际水稻基因组计划中， 它是作为一种典型的粳稻基因组供体， 同时已完成全基因组测序。
1.2 水稻 Osddm1a/1b 纯合双突变体的获得1.2.1 OsDDM1-CRISPR 载体的构建首先在 OsDDM1a/1b 基因序列中寻找 23bp 的像 GN19NGG（或 GN19NAG 作为备份）这样的靶序列（ NGG 上游第 20 个碱基为 G 的序列优先进行选择）， 并设计一对引物用于产生一段有精确突出端的 DNA 片段： 上游引物为 5’-TGTGT-G(N19)-3’， 下游引物为5’-AAAC-(N19)CA-3’；接着进行退火和连接反应： 将正向和反向引物用 ddH2O 溶解至 10μM，取 1μl 加入到 8μl Anneal Buffer(TE+50mM NaCl)中，并用移液枪吸打混匀； 利用 PCR 仪进行慢速冷却的退火程序，从 95℃以 0.1℃ /s 的速度降到 16℃； 建立 10μl 的连接反应体系，将退火反应的产物连接到用 BsaI 酶切得到的载体（图 2A） 上，连接程序为保持 25℃ 2h：表 1 -1 pCBSG03 载体酶切反应的体系与程序Table 1 -1 . The system and procedure of enzyme digestion for pCBSG03.组分 体积体系（ 50μl） Buffer Cutsmart 5μlBsaI 限制性内切酶 1 μlpCBSG03 质粒 5μgddH2O To 50μl程序 温度： 37℃ 时间： 2.5h表 1 -2 退火产物连接反应的体系与程序Table 1 -2. The system and procedure of ligation for annealing product.组分 体积体系（ 10μl） 退火反应产物 1μlBsaI 酶切 pCBSG03 载体 1μl10×T4 Buffer 1μlT4 连接酶 0.5μlddH2O 6.5μl程序 温度： 25℃ 时间： 2h1.2.2 大肠杆菌转化将连接产物转入大肠杆菌感受态细胞： 事先将恒温水浴的温度调整到 42℃；从-80℃环境下取出大肠杆菌 DH5α 感受态菌置于冰上使其融化，冰浴 5 至 10min； 取 50μl 感受态细胞于 1.5ml 离心管中，向其中加入 5μl 质粒，轻轻震荡后冰置 20min；摇匀后置于42℃环境， 水浴 90sec 进行热休克， 使质粒顺利通过在大肠杆菌细胞膜上形成的空隙并进入菌内，然后迅速放回冰上，静置 2min；在超净工作台向上述离心管中加入 600μl 不含抗生素的 LB（ Lysogeny broth）液体培养基，轻轻混匀，然后于 37℃摇床上振荡培养45min；倒入加卡那霉素（ Kanamycin, Kan） 抗性的 LB 固体培养基，用酒精灯烧过并降温的玻璃涂布棒涂布均匀，吹干后用封口膜封上， 37℃培养直至有圆形的单克隆长出。菌落 PCR 鉴定阳性单克隆： 挑取单克隆进行菌落 PCR（图 2B），鉴定出接头引物连入 pCBSG03 载体的阳性单克隆， 培养菌提质粒并进行测序验证其是否正确，测序引物是用载体上的引物 U6aF
上一篇：光慈姑化学成分系统预试验