与番茄斑萎病毒核衣壳蛋白N互作的寄主因子筛选(2)
致谢…10
参考文献11
图1 N-N∆46C∆82的扩增…6
图2 菌落PCR验证结果6
图3 pGBKT7-N-N∆46C∆82筛库结果在QDO/X培养基生长情况…7
图4 文库质粒菌落PCR验证结果7
图5 共转化验证QDO/X培养基生长情况…8
图6 共转化验证结果示意图8
表1 13种可能与pGBKT7-N-N∆46C∆82互作的寄主因子8
与番茄斑萎病毒核衣壳蛋白N互作的寄主因子筛选
引言
TSWV是布尼亚病毒科（Bunyaviridae）番茄斑萎病毒属（Tospovirus）的典型成员，属于植物多分体负义链RNA病毒。1915年TSWV首次发现于澳大利亚，其后在世界各地广泛传播，造成巨大的经济损失，其在2011年列出的世界危害最大的十种病毒中名列第二[1]。
TSWV寄主范围十分广泛，可侵染84个科1000多种植物，其中茄科、葫芦科、菊科和豆科植物受害较为严重[2]。感染TSWV的植物多为系统性侵染，植株矮化，叶片皱缩形成不对称生长，叶片上可见坏死环斑或不规则的坏死区，严重时整个叶片甚至整个植株坏死呈萎蔫状。TSWV粒体呈近球形，有包膜，病毒粒体中含有病毒的核衣壳蛋白复合体，由核衣壳蛋白N、基因组RNA和少数几个拷贝的复制酶（RNA dependent RNA polymerase, RdRp）组装而成。病毒基因组为三分体单链RNA，根据其分子量大小分别命名为L RNA、M RNA 和S RNA。其中，L RNA长约9 kb，通过负义链编码一个开放阅读框即RdRp。M RNA为双义RNA，正义链编码移动蛋白NSm，反义链编码糖蛋白Gn和Gc。S RNA也是双义RNA，正义链编码RNA沉默抑制子NSs，反义链编码核衣壳蛋白N[3]。
截至目前，关于TSWV产生系统性坏死症状机制的研究还不多。南京农业大学分子植物病毒实验室前期研究中，以马铃薯 X 病毒（Potato virus X, PVX）为载体在本氏烟中瞬时表达TSWV编码的核衣壳蛋白N可产生类似于病毒侵染所造成的系统性坏死症状，故将N确定为病毒导致系统性坏死症状的决定因子。本实验在前期研究基础上展开，利用酵母双杂交技术，筛选与TSWV N及其致死重要区段N-N∆46C∆82互作的寄主靶标因子，对揭示TSWV诱导植物产生系统性坏死的致病分子机制具有重要的科学意义。经过多次筛选，TSWV N因其自身可形成多聚体结构，暂时未筛到阳性克隆；TSWV N致死重要区段N-N∆46C∆82共筛到3个阳性克隆，经测序分析后寄主因子均为Nicotiana tabacum F-box protein FBW2-like，故推测其可能与寄主F-box类蛋白互作从而干扰其调节功能进而导致坏死症状。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 菌株、质粒、目的片段、文库
大肠杆菌DH5α菌株、Y2H Gold酵母菌株；质粒pGBKT7、pGADT7、pGBKT7-53、pGADT7-T、pGBKT7-N；目的片段N-N∆46C∆82由特异性引物P2175和P2097以表达载体p2300-N为模版扩增得到；本氏烟cDNA文库为实验室购置，-80℃保存。
1．1．2 培养基
SD/-Trp
SD/-Leu
SD/-Leu/-Trp(DDO)
SD/-His/-Leu/-Trp(TDO)
SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp(QDO)
SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal(QDO/X)
LB、2×YPDA、1×YPDA、0.5×YPDA
1．1．3 生化及分子生物学试剂
T4 DNA Ligase、Prime Star DNA聚合酶购自TaKaRa公司；Taq Plus聚合酶、dNTPs均购自Sangon Biotech公司；Trans 2K plus DNA Marker 购自全式金生物科技有限公司；凝胶回收纯化试剂盒购自上海捷倍思公司；实验室用限制性内切酶购自TaKaRa公司和NEB公司。
0.9% NaCl溶液、100% DMSO、去离子水（ddH2O）；Kanamycin（Kan）、Ampicillin（Amp）；10 mg/mL Sperm DNA（新配制时水浴煮沸20分钟，立即插入冰浴，保存于-20℃）。