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与番茄斑萎病毒核衣壳蛋白N互作的寄主因子筛选(3)
10×TE:0.1 M Tris-HCl,10 mM EDTA,pH=7.5
10×LiAc:1 M LiAc, 用稀释的醋酸调pH=7.5
1.1×TE/LiAc(10 mL):1.1 mL 10×TE溶液,1.1 mL 10×LiAc溶液,7.8 mL ddH2O
PEG/LiAc(10mL):8 mL 50% PEG 4000,1 mL 10×TE溶液,1 mL10×LiAc溶液
1.2 方法
1.2.1 质粒的提取
(1)用2 mL离心管取1-5 mL在LB培养基中培养过夜的载体pGBKT7的菌液(若使用丰富培养基,菌液体积应减半或更少),12000 rpm离心2 min,弃尽上清,在纸巾上轻扣几下;
(2)加入250 µL已加Rnase A的Buffer I,涡旋震荡悬浮细菌沉淀,如果沉淀过紧可用1 mL吸头吹打数次,直至悬浮均匀,不应留有小的菌块;
(3)加入250 µL的Buffer II,温和并充分地上下翻转混合4-6次,使菌体充分裂解,直至形成澄清透亮的溶液。此步骤不宜超过5 min;
(4)加入350 µL的Buffer III,温和并充分地上下翻转混合6-8次,形成紧实的沉淀,12000 rpm离心10 min;
(5)吸取步骤(4)中的离心上清并转移到DNA制备管(置于2 mL离心管)中,12000 rpm离心1 min,(回到一次)弃滤液;
(6)将制备管置回离心管,加500 L wash I,12000 rpm离心30 s,(回到一次)弃去滤液;
(7)将制备管置回离心管,加700 L wash II,12000 rpm离心30 s,弃去滤液;以同样的方法再加700 L wash II洗涤一次,12000 rpm离心30 s,弃去滤液;
(8)将制备管置回2 mL离心管中,12000 rpm离心3 min;
(9)将制备管置于干净的1.5 mL离心管中,在DNA制备膜正中央加60-80 L Eluent或去离子水(后续实验用于DNA测序请使用自备去离子水洗脱),室温静置1-2 min。12000 rpm离心1 min。弃纯化柱,洗脱的DNA保存于-20℃备用。
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