基于16SrRNA基因序列甲拌磷污染底泥细菌多样性研究(3)
尽管许多学者研究过甲拌磷对于土壤中细菌群落的影响，但是很少有人研究生产甲拌磷农药厂所排放的未经处理的废水对于土壤中细菌的多样性的影响。土壤是微生物生活的大本营，1g土壤中存在成千上万种多达100亿个微生物个体[12]。而由于传统的培养技术的限制[13,14,15, 16]，土壤中含有的微生物种类繁多，目前能够培养的土壤微生物的种类却很少[17,18]，传统的培养技术仅能分离1 %～10 %的土壤微生物[19]，此外，重培养的过程因其本身就是再选择的过程，导致应用常规的培养方法无法全面地反映土壤微生物资源状况[20]。近年来发展了三类不需培养的方法来研究土壤微生物的种类和数量，这些方法大体上分为生物化学、生理学和分子生物学三类，而分子生物学方法是应用较为广泛的方法，1980年以来，已被广泛应用于土壤微生物群落遗传多样性的研究[21]，其基本步骤是提取土壤的总DNA，然后用通用引物或选择性高的引物来扩增16S rRNA 基因[22]。因此，我们设计此课题，通过454焦磷酸测序技术，重点阐述未经处理的甲拌磷废水对于土壤中细菌多样性的影响。而且我们将在排污口取样和距离排污口约2 km的底泥中的细菌的多样性进行了对比，并明确这两个地点的优势菌种，对开发利用土壤中丰富的微生物资源以及验证微生物对甲拌磷具有一定的降解能力提供了参考依据。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1采样
土样采集于已废弃的铜山农药厂。
1.1.2 样点描述
铜山农药厂位于徐州市三堡镇三堡村（东经117°09′—117°11′，北纬34°07′—39°09′）。年平均气温13.9 °C,平均年降水量868.6 mm，年无霜期平均为210 d，年太阳辐射总量119.4千卡/平方厘米，平均日照时数2283 h。
1.1.3 样品采集
于2014年12月采集自徐州市三堡村的已废弃的铜山农药厂排放废水的地方，共两处：一处位于排放废水的出水口(NYC)，另一处位于距离出水口约2 km的污染底泥中(NYCDN)。这两处样品均取距离土层表面 的土壤，操作过程带无菌手套，避免污染并将样品置于 的无菌离心管中，去除样品中带有的植物残体、砂石等大颗粒后，立即运回实验室，并存于 保存备用。
1.2 方法
1.2.1 土壤总DNA提取
提取样品的总基因组DNA，采用试剂盒：OMEGA公司E.Z.N.A土壤样品DNA试剂盒。抽提基因组DNA之后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.2 PCR扩增和胶回收
PCR模板：抽提出的总基因组。根据细菌基因特点，设计正向引物27F，其序列为：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；设计反向引物533R序列为：5’- TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’[23]。根据表1.1设置反应体系，并进行扩增。本研究中，每个样品设置3个重复，将同一样品的 PCR产物混合后，2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用 凝胶回收试剂盒（ 公司）切胶回收 PCR产物， 洗脱；2%琼脂糖电泳检测。
PCR采用TransGen ：TransStart Fastpfu DNA Polymerase；
PCR仪：ABI GeneAmp® 9700 型；
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