水稻地方品种黑壳子粳稻瘟病抗性基因Pi-hk2的精细定位(2)
1 材料与方法
1.1 植物材料与幼苗培养
1.1.1 植物材料 太湖流域抗稻瘟病粳稻地方品种黑壳子粳、感病品种苏御糯、黑壳子粳×苏御糯构建的重组自交系群体 RILs（Recombinant Inbred Lines）中抗病家系RIL84 与感病亲本苏御糯回交产生的BC1F4和BC1F5群体。
1.1.2 幼苗培养 在30℃条件下，将亲本、不同家系的水稻种子用 10%的浸种灵（1︰5000）浸种2 d，自来水冲洗后催芽1 d 至露白，播于塑料育秧盘（60 cm×30 cm×4 cm）中。每盘播 8行，每行 3 穴，共 24 穴，每穴 6-8 粒发芽种子。每盘播种黑壳子粳和苏御糯各一穴作为抗病及感病对照，设三个重复。播种后，表面覆盖一层薄土。 幼苗生长到 2叶 1心的时候施尿素一次，每秧盘约 2 g左右，接种前 3 d 再施一次尿素，使秧苗嫩绿，以利于接种后的发病。当幼苗生长至三叶一心期（播种后 20 d左右）时，将秧苗移至分层隔离接种箱（80×50×40 cm3）内进行喷雾接种[13]。 1.2菌株及产孢培养 菌株选用江苏省优势小种 2010-9（G1），由江苏省农业科学院植物保护研究所提供 [14]。 将干燥保存的稻瘟病菌株转接到马铃薯琼脂糖培养基的斜面上进行活化， 26 - 27 ℃的恒温培养箱内培养一周后，移接至玉米粉稻秆汁培养基上，进行产孢培养。在26 - 28 ℃的恒温箱内培养 10 - 12 d 后，放置于黑光灯（20 W）下进行产孢，于 25℃条件下培养7 - 10 d 后，会有大量分生孢子产生[15]。 1.3 接种与抗性鉴定 用无菌蒸馏水洗下培养基表面的稻瘟病菌孢子，经双层纱网过滤后，将孢子悬浮液配制成浓度为 5×104个孢子/ml，即在 10× 10 倍显微镜下约 30 - 40 个孢子/视野，加入 0.02% Tween-20 作为表面活性剂。用连接气泵的喷枪在分层隔离接种箱内喷雾接种，每个秧盘内接种40 - 50 ml 的孢子悬浮液[16]。接种箱内黑暗保湿24 h 后转移至遮荫苗床。苗床温度保持在 25 ℃左右，并定时喷雾保湿（白天间隔两小时喷雾一次，每次 1 - 2 min）。接种7 d后调查记录水稻叶片上病斑数目和病斑大小两个指标 [12]。病斑大小的分级参考Mackill 和 Bonman的方法（表1-1）[17]。 表1-1 病害级别参考表 病级 症状 0级 无任何病斑 1级 仅有褐色小圆点，中央部分无坏死 2级 病斑小圆形，中央部分灰白色，边缘褐色，中央部分直径不超过1 mm 3级 病斑圆形，中央部分灰白色，边缘褐色，中央部分直径不超过2 mm 4级 病斑纺锤形，中央灰白色，边缘褐色，中央部分直径不超过2 mm 5级 病斑纺锤形，中心灰白色，无褐色边缘，直径超过2 mm 统计时，将 0 - 2 级归为抗病类型，3 - 5 级归为感病类型。