产扁桃酸脱氢酶菌株的分离和酶的提取纯化(3)
1.1.2 手性扁桃酸
扁桃酸（又称苦杏仁酸），由于具有生物分解性，常常作为药物合成的中间体，同时也常用来作为染料合成中间体[6]。手性扁桃酸有两种外消旋体，其中R-(-)-扁桃酸常用于生产某些抗生素的侧链修饰剂，而S-(+)-扁桃酸则用来生产某些抗利尿药物的前提原料[7]。目前为止这两种外消旋体的混合物已经可以通过化学合成实现工厂化生产[8-11]，并且价格不是很高。
1.2 R-(-)-扁桃酸脱氢酶
扁桃酸是重要的手性药物中间体和精化工产品[12]。临床药理学研究表明，不同构型的扁桃酸对映体具有不同的生理活性，其中S-（+）-扁桃酸具有较强的神经毒性[13]。因此研究R-（-）-扁桃酸的生物不对称性合成，对于进一步研发R-（-）-扁桃酸系列药物非常有必要，这一方面的研究对于临床用药和保障人类健康有着极大的社会意义[14]。R-（-）-扁桃酸制备的现行工艺是以化学合成的外消旋体为出发物的手性化学拆分技术路线。手性拆分试剂昂贵，并且造成资源浪费和环境污染[12]。考虑到以上合成中的不利因素，成功的开拓出一种新的获得R-（-）-扁桃酸的方法对科学家们来说是一种全新的挑战。随着人们对该领域的不断探索与研究，对于扁桃酸脱氢酶的研究也逐渐成熟，实验表明利用分离酶R-（-）-扁桃酸脱氢酶进行催化合成扁桃酸，专一性强，只能催化R-（-）-扁桃酸的合成，副产物少，反应后处理简单[15,16]。
由于上述诸多有关扁桃酸脱氢酶的研究必要性的论述，所以有必追随下它的研究进程。1998，Fewson等人指出，在自然界中，大多数细菌和真菌均能能以R-（-）-或S-（+）-扁桃酸或RS-扁桃酸为唯一碳源和pu能量[17]。早在二十世纪末，A cmetobacter calcoaceticus, Pseudomonas putida等人就对扁桃酸脱氢酶进行了定义，他们指出扁桃酸脱氢酶是NAD（P）依赖的黄素为辅基的膜整合蛋白，这样的蛋白被定义为扁桃酸脱氢酶[18,19]。同时，粪链球菌的羟异己酸脱氢酶和乳酸杆菌的R-（-）-扁桃酸脱氢酶也已经被纯化并定义，上述这两种酶都是可溶的NAD+依赖的酶[20,21]。1984，Durham等人在研究中指出在红酵母中，初步证据表明染料连接的S-（+）-扁桃酸脱氢酶和NAD+依赖的R-（-）-扁桃酸脱氢酶的存在,这是首次在扁桃酸氧化过程中涉及到NAD+依赖的脱氢酶的清晰例子[15]。1998年DARRENP.BAKER and CHARLES A.FEWSON首次开展真核状态的扁桃酸脱氢酶的研究，他们成功地从红酵母菌种 KGX 39中分离并纯化得到一种可溶的NAD+依赖的脱氢酶，并初步对其定性，研究了多种因素对其的影响情况，其中包括pH，底物，辅因子和抑制剂特异性，动力学特性，等电点，分子量，氨基酸分析（待分析的氨基酸种类占总氨基酸数的三分之一）等的影响[22]。2002年英国爱丁堡大学的Stephen等人确定了R型和S型扁桃酸脱氢酶的结构，对其进行了克隆并将其成功地在E.coli中表达，通过对重组后酶特性的研究，完成了更好的改造和提升酶活性及催化效率的工作[23]。红酵母扁桃酸脱氢酶S.faecalis内的L-（+）扁桃酸脱氢酶（也即S-（+）扁桃酸脱氢酶）和L.curvatus内的D-（-）-扁桃酸脱氢酶（也即R-（-）-扁桃酸脱氢酶）都是异二聚物，它们在式量，四组分结构，辅因子特异性，催化反应的可逆性，活性pH依赖性，金属螯合剂的影响方面具有相似的规律[24]。A.calcoaceticus内的R，S扁桃酸脱氢酶都是黄素依赖膜整合蛋白，能够催化扁桃酸的不可逆氧化[25]。在细胞内定位，式量，四组分结构，等电点，最适pH，辅因子，对硫醇试剂的敏感性不同于红酵母R-（-）-扁桃酸脱氢酶。它们同P.putida内的R,S扁桃酸性质相同，都是膜结合蛋白，以黄素作为辅因子[26]。Hummel等[27]从Lactobacillus curvatus DSM 20019,一种弯曲乳杆菌，菌株中分离出一种扁桃酸脱氢酶，经过检测知该酶为同型二聚体，其亚基的相对分子质量为30 000，对该酶的性质进行进一步研究发现它能够催化反应一系列的芳香酮酸和脂肪酮酸。Yamazaki等[28]从一种粪链球菌（Streptococcus faecalis IFO 12964 ）中提取出一种R-(-)-扁桃酸脱氢酶（同型二聚体，亚基的相对分子质量为34 000），并证明可以利用这种酶催化底物苯乙酮酸实现R-(-)-扁桃酸的合成，同时也可用来合成其他类型的2-羟基羧酸。Baker等[29,30]从红酵母(Rhodotorula graminis KGX 39)中提取到另外一种R-(-)-扁桃酸脱氢酶，该酶也是同型二聚体，其亚基的相对分子质量为38 000，并初步地研究了这种酶的催化反应机理及其活性位点。其实早在上个世界八十年代国外就有报道采用乳酸杆菌、酵母等微生物合成R-（-）-扁桃酸，发现不同微生物的扁桃酸脱氢酶的光学选择性等性质。进而引出不同类型的扁桃酸脱氢酶有一定的亲缘关系，分析原因可能由共同的原始链分支进化而来。通过对具有代表性的脱氢酶的氨基酸序列进行比较，研究保守或相对保守的氨基酸残基与脱氢酶的结构与功能相关联的要素[31]。然而对于恶臭假单胞菌FJ506中的R-(-)-扁桃酸脱氢酶的分离与纯化工作国内却鲜有相关报道[32]。因此本课题的实验研究显得更有意义。
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