产扁桃酸脱氢酶菌株的分离和酶的提取纯化(4)
目前对于R-（-）-扁桃酸脱氢酶的提取一般采用常规性的胞内蛋白酶的提取方法，而对于该酶的纯化工作就显得比较多样[33]。同时R-（-）-扁桃酸脱氢酶的纯化效率也是目前对该酶研究中遇到的主要问题。粗酶提取液成分复杂，目的酶浓度较低，常用初步分离纯化的步骤除去大部分与目的产物物理化学性质差异较大的杂质[34]。通常采用离子交换层析的方法完成初步分离纯化，由于蛋白质可从大量缓冲液中被分离，所以该方法更适合蛋白质粗提物的初始纯化。疏水作用层析也常常应用于蛋白酶的纯化，以介质疏水基团和蛋白质疏水区域间的亲和作用为基础，可溶性蛋白在外表面存在疏水小区，是疏水配基结合部位或活性部位。另外，溶液盐溶液浓度增加时，疏水作用变强[35]。因此，大多数疏水层析程序采用梯度洗脱，所以在离子交换层析后可以直接进行疏水层析纯化。温和的洗脱条件及高蛋白质结构容量使疏水层析在蛋白质纯化中成为很有价值的纯化，起到一定的浓缩作用[15]。此外亲和层析也是一种很有效的纯化方法。蓝色染料的芳香族结构和磺酸基团的空间结构和电荷性质类似于核苷酸，包括环核苷酸、黄索核苷酸、多核苷酸等，能够结合40多种酶和蛋白质[12]。包括以NAD、NADP为辅酶的氧化还原酶、与辅酶A有关的酶、磷酸激酶、水解酶、糖解酶、脱羧酶、RNA和DNA的核酸酶和聚合酶、磷酸二酯酶以及一些血液蛋白和干扰素等[6]。
酶活性的测定主要利用辅酶NAD在接受一个电子后变为NADH，而NADH在340nm波长下有最大吸光值，通过紫外分光光度计测定NADH在340nm波长下吸光值的变化，对比NADH浓度的标准曲线来测定酶活大小[10]。
纯化后的样品纯度的检测方法有很多，其中以电泳、高效液相色谱法为主。前者采用SDS-PAGE检测。亲和层析纯化后的酶液进行活性电泳，在对跑出来的胶进行活性染色，活性染色法主要是利用R型扁桃酸脱氢酶在辅因子NAD的存在下催化反应扁桃酸产生NADH，而后NADH通过PMS电子传递体使NBT从淡黄色的氧化态变为蓝色的还原态，从而使具有活性的酶显色[18，19]。
1.3 课题研究背景及意义
虽然目前R-型和S-型两种外消旋扁桃酸的混合物已经实现了工厂化生产，但是对于其中某一种扁桃酸的纯化工作仍然是现在面临的一个主要问题[36]，生产其中一种扁桃酸的成本仍然很高，而且利用现有的方法合成单一一种扁桃酸采用的拆分试剂昂贵,并且容易造成环境污染和资源的浪费[37]。
本课题充分体现了绿色生物理念，设计了一种专一的催化底物R-（-）-扁桃酸获得S-（+）-扁桃酸的方法，实现了对于S-（+）-扁桃酸的纯化工作。从实验室保存的F系菌种中筛选得到产R-（-）-扁桃酸脱氢酶的菌株，鉴定为恶臭假单胞菌FJ506，通过对恶臭假单胞菌FJ506发酵条件的优化实现对R-（-）-扁桃酸脱氢酶的高产。通过一系列的纯化操作得到纯度较高的R-（-）-扁桃酸脱氢酶，利用其专一性，催化底物外消旋扁桃酸，获得较纯的S-（+）-扁桃酸。
此方法简单、环保，是一种新型的生产S-（+）-扁桃酸的方法，同时也为今后手性问题的解决提供了理论指导。
1.4 主要研究内容及任务
以NAD为辅酶的R-(-)-扁桃酸脱氢酶催化反应R-扁桃酸生成苯乙酮酸的过程，伴随着氧化还原反应，其中NAD不断被还原成NADH，若要保证反应的持续进行，需补充NAD的量。
本课题从产R-扁桃酸脱氢酶的菌株的筛选开始，逐步优化发酵条件，实现菌体产量的最大化的同时保证酶量的最大化，紧接着借助一系列蛋白酶分离纯化的方法实现对R-(-)-扁桃酸脱氢酶的提纯，并通过对其酶学性质的研究，确定最适的反应条件，进一步提升反应速率。
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