摘要中国石龙子（Eumeces chinensis）属于爬行纲(Reptilia)、有鳞目(Squamata)、石龙子科(Scincidae)、石龙子属(Eumeces)，主要分布在我国南部（台湾、海南）和越南。近年来，随着环境的逐渐恶化，中国石龙子-野生资源日渐枯竭，种群数量锐减，故人们开始关注其应对环境压力的分子机制。在哺乳动物中的研究发现MT、Bcl-2和P53是典型的应对环境压力的基因。本文使用降落PCR、巢式PCR和RACE等基因克隆技术克隆出了中国石龙子MT、Bcl-2和P53的基因全长；并通过多重序列比对发现推测的ec-MT、ec-Bcl-2与ec-P53蛋白序列和不同物种中MT、Bcl-2和P53蛋白序列具有高度的相似性。43961

毕业论文关键词： MT； Bcl-2； P53； 基因克隆； 中国石龙子

Abstract Eumeces chinensis belongs to to Reptilia, Squamata, Lacertilia, Scincidae and mainly distributes in the south of China (Taiwan、Hainan) and Vietnam. In recent years, with the gradual deterioration of the environment, the wild Eumeces chinensis population decreased rapidly, so people began to focus on its responsable molecular mechanisms to environmental pressures of. The findings in mammalians reveal that MT, Bcl-2 and P53 genes are the typical stress responsible genes. In our study, we used touch down PCR, nested PCR and RACE technique to clone the MT, Bcl-2 and P53 gene in Eumeces chinensis. And find the presumed protein sequence of ec-MT, ec-Bcl-2 and ec-P53 are high degree of similarity to other species’ MT, Bcl-2 and P53 gene by multiple sequence alignment. 

Keyword:  MT； Bcl-2； P53； Gene clone；Eumeces chinensis

目    录

1 引言 1

2 实验材料和仪器 1

2.1 实验动物 1

2.2 实验相关试剂以及试剂盒 1

2.3 实验仪器 2

3 实验方法 3

3.1 中国石龙子精巢MT、Bcl-2和P53的克隆 3

3.2 PCR基因产物电泳检测、回收和纯化 15

3.3 PCR产物与载体连接 15

3.4 克隆载体转化和检测 16

3.5 MT、Bcl-2和P53的cDNA序列和蛋白序列的分析 16

4 实验结果 16

4.1 ec-MT、ec-Bcl-2和ec-P53基因的cDNA和蛋白质序列 16

4.2 ec-MT、ec-Bcl-2和ec-P53蛋白多序列比对和进化分析 19

4.3 ec-MT、ec-Bcl-2和ec-P53蛋白结构分析 25

5 讨论 27

5.1 ec-MT、ec-Bcl-2与ec-P53的基因和蛋白序列特点 27

6 总结 28

7 展望 29

参考文献 30

致  谢 34

近年来，随着自然环境的恶化，例如气温的升高，环境污染的加重等，动物的繁衍受到了极大的影响。近期数据(Beyersmann & Hartwig 2008)表明中国石龙子的野生资源日渐枯竭，种群数量锐减。经研究发现，MT、Bcl-2和P53基因是典型的应对环境压力的基因，它们在机体受到不同环境压力时能诱导体内一系列的变化以应对并化解环境毒害，或者通过诱导凋亡的方式来清除异常细胞以保护自身(Eischen et al. 2001; Mihara et al. 2003; Levine 1997; Albrechtsen et al. 1999; Vogelstein et al. 2000)。

重金属镉是一种非必需金属元素，它很难被生物降解，可通过食物、水和空气被机体吸收从而对机体产生重大伤害(Jin et al. 1997)。金属硫蛋白（MTs）是应对镉毒性的有效武器，它具有很强的清除自由基的能力，是动物体内解毒、调节重金属稳态和抗氧化应激的重要蛋白(Cai et al. 2006; Adam et al. 2008)。而Bcl-2蛋白具有抗氧化作用，它可以抑制细胞内ROS的生成及其活性，从而抑制由ROS诱导的凋亡(Chong et al. 2014)。此外Bcl-2蛋白还可诱导细胞内源性抗氧化剂的表达并增强其活性，以清除代谢过程中产生的多余ROS(Chong et al. 2014)。现有结果表明，P53是一种受内、外部压力（DNA损伤、热激、低氧、氧化氮等）诱导的转录因子，在细胞周期停滞、凋亡和抑制包括精巢在内的不同组织中血管形成的过程中均具有重要作用(Levine 1997; Albrechtsen et al. 1999; Vogelstein et al. 2000)。