参考文献 12

致 谢 13

引言保加利亚乳杆菌从发现至今已有100多年了。在20世纪初的时候，保加利亚的科学家就在酸奶中发现了保加利亚乳酸杆菌，并从中将其分离出来[1]。但是游离的保加利亚乳杆菌十分脆弱。保加利亚乳杆菌的代谢活动在pH=3.5的环境中受到抑制[2-3]。研究发现，当保加利亚乳杆菌进入人体后要获得科学家所想要的良好的益生作用，其活菌数必须达到一定的量[4]。因此，寻找一种既要对益生菌进行保护，又要保证安全无毒副作用并具有食用性的方法十分重要。通过科学家多年的大量的理论和实验研究，可以发现将益生菌微胶囊包埋化是目前为止保护益生菌的最为有效的一种手段。到目前为止，海藻酸钠和植物蛋白都是较受欢迎的包埋壁材之一[5]。本文主要用海藻酸钠和豆类蛋白组成混合材料包埋保加利亚乳杆菌，并对游离和包埋菌的稳定性进行研究。

1 材料和方法

1.1 材料 

保加利亚乳杆菌（从酸奶中提取纯化）、海藻酸钠、红豆蛋白粉、绿豆蛋白粉、大豆蛋白粉、猪胆盐试剂、Cacl2溶液、宁盐酸、0.85 %NaCl、无菌水、一次性注射器、试管、培养皿等。

1.2 菌种的获取和保藏

1.2.1 菌种获取

从光明酸牛奶中（包括保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌），取1.0 mL酸奶接到10 mL的pH=5.4[6]的MRS液体培养基中，37 ℃培养24 h。取菌悬液1.0 mL，重复上述步骤。取最终得到的菌悬液，在pH=5.4的MRS培养基上多次划线涂布，逐渐获得较明显的单菌落。挑选单菌落，在显微镜下通过镜检选出保加利亚乳杆菌的单菌落。从挑出的保加利亚乳杆菌的单菌落中划线涂布出新的纯的保加利亚乳杆菌单菌落。将得到的培养基置于4 ℃下保藏。

1.2.2 菌种保藏

从保藏的培养基中将菌种接到70 mLMRS培养液中，置放于摇床（37 ℃，200 rpm）培养24小时后，取菌液和灭菌过的50 %的甘油以1∶1的比例混合，保藏于-20 ℃的冰箱中。

1.2.3菌种活化和菌悬液制备

将得到的菌种接在固体MRS培养基中，在37 ℃的条件下培养24 h，活化两次。

从培养基中将一个单菌落接到70 mLMRS液体培养液中，置放于摇床（37 ℃，200 rpm）培养24小时。取上述菌液10 mL于离心管中，置于离心机中离心（4 ℃，3000 r/min），10分钟后弃上清液，留下沉淀，用无菌水洗涤两遍。

在离心管中加30 mL灭过菌的0.85 % NaCl溶液，摇匀，得到保加利亚乳杆菌的菌悬液。测得在600nm分光下菌液OD值为0.436的菌悬液。

1.3 包埋体系的优化试验

1.3.1 壁材的适宜配比

将不同浓度的海藻酸钠溶液和不同种类不同浓度的蛋白质溶液按不同比例混合，寻找合适的利于包埋、溶解和保藏的比例。

用2.0 %的海藻酸钠溶液分别与在80 ℃中加热20 min的浓度为4.0 %、6.0 %的红豆蛋白溶液以分别1∶1、1∶2、1∶3和1∶4的比例混合，用1.0 mL的一次性注射器将混合液滴进0.1mol/L的Cacl2中凝固，20min后取出，用无菌水冲洗。取0.20 g微胶囊置于10 mL的pH=7.4的0.10 mol/L的KH2PO4溶液中在摇床（37 ℃，175 r/min）中释放2小时左右。

用1.5 %的海藻酸钠分别和在80 ℃中加热20 min的浓度为1.0 %、1.5 %、2.0 %的红豆蛋白溶液[7]分别以1∶1、1∶2、1∶3和1∶4的比例混合，按以上方法凝固成球后在KH2PO4溶液中释放2 h左右。

用1.0 %的海藻酸钠溶液分别和在80 ℃中加热20 min的浓度为1.0 %、1.5 %、2.0 %的红豆蛋白溶液分别以1∶1、1∶2、1∶3和1∶4的比例混合，以同样的方法凝固成球后在KH2PO4溶中释放2小时左右。结果发现1.0 %的海藻酸钠溶液和1.0 %的红豆蛋白溶液以1∶1的比例混合的微胶囊完全溶解。