2.6 热击转化 11

2.8质粒的双酶切鉴定 11

2.9 载体质粒电转导入农杆菌 12

2.10 农杆菌的培养与侵染 12

2.10.1普通烟草幼苗的准备 12

2.10.2农杆菌的培养 12

2.10.3农杆菌侵染 12

2.11 GFP荧光检测与成像 12

2.12 本氏烟植物基因组DNA的粗提取（TPS方法） 13

第二章 外源基因特异表达系统的构建 14

引言： 14

实验流程图 15

外源基因特异表达系统的构建 16

2.1 ACMV病毒全长序列分析 16

2.2 Ori区序列的分析 16

2.3 引物设计 16

2.4 First Ori序列的基因的聚合酶链式反应（PCR） 17

2.5 Ori序列的基因PCR回收产物的纯化 17

2.6 First Ori序列插入pCAMBIA2300: FT:EGFP 17

2.6.1 pCAMBIA2300: FT:EGFP载体、First Ori片段酶切 17

2.6.2电泳检测目的片段及结果 17

2.6.3 双酶切后pCAMBIA2300: FT:EGFP的载体、First Ori片段纯化 18

2.6.4 First Ori与pCAMBIA2300: FT:EGFP载体片段的连接 18

2.6.4 连接产物的转化 18

2.6.5 pCAMBIA2300: 1stOri: FT:EGFP重组质粒的检测与获得 18

2.7 Second Ori基因片段插入pCAMBIA2300:1stOri:EGFP质粒 19

2.7.1 Second Ori序列的基因的聚合酶链式反应（PCR） 19

2.7.2 pCAMBIA2300:1stOri: FT:EGFP载体、Second Ori片段酶切 20

2.7.3 pCAMBIA2300:1stOri:FT:EGFP载体及Second Ori片段纯化及连接转化 21

2.7.4 pCAMBIA2300:Ori2:FT:EGFP重组质粒的检测与获得 21

2.7.5 pCAMBIA2300:Ori2:FT:EGFP重组质粒的测序检测 22

2.8载体质粒电转导入农杆菌 22

2.9 农杆菌的浸润接种 22

2.10 通过荧光显微镜检测接种植物的GFP荧光 22

2.11 接种植物接种部位的DNA抽取 23

2.12 通过特异引物的PCR检测目的环状DNA分子。 23

讨论 24

致谢 25

参考文献 26

 引言：

双生病毒是一种广泛发生的植物单链环形DNA病毒，它在电镜下呈孪生颗粒形态，病毒粒子大小约30*20nm[1,2]。据统计，至少有39个国家的番茄、棉花、木薯等作物正在遭受粉虱传双生病毒的危害,很多情况是毁灭性的。自上世纪90年代起，这种病毒已在印度、巴基斯坦等周边国家多次爆发流行，而且在我国大部地区相继发现。经鉴定，近年来在我国发现的粉虱传双生病毒有中国番茄黄曲叶病毒、中国南瓜曲叶病毒、云南烟草曲叶病毒、烟草曲茎病毒、赛葵黄脉病毒等数十个新种[3,4,5]。已在番茄、烟草、南瓜等多种作物上造成严重危害，灾情严重的常常减产过半甚至绝收[6,7,8,9]。非洲木薯花叶病毒（Africa cassava mosaic virus，ACMV）属于双生病毒科，菜豆金色花叶病毒属。1974年Bock等从玉米和甘蔗上首次分离到该病毒，1977年英国苏格兰研究所的B.D.Harrison根据病毒的形态命名该病毒，由于在电镜下呈现孪生颗粒形态，因此称其双生病毒。由于双生病毒毒，由于在电镜下呈现孪生颗粒形态，因此称其为双生病毒。由于双生病毒基因组易发生突变、重组和重配从而产生新的病毒[10,11,12,13]，产生新的致害性更强的病毒，造成此类病毒病的大流行[14,15]。这些新病毒大多对宿主和环境有较强的适应性，加之其传播媒介是烟粉虱，所以传播范围广且迅速防御起来比较难。过去的几十年，双生病毒在众多的粮食作物（小麦、木薯、大豆、玉米等）和纤维作物上引起严重的危害，给人们造成巨大的经济损失。粉虱传双生病毒的病毒复制与重组是该类病毒病灾变规律研究中的核心所在，对双生病毒的复制蛋白的结构和功能的研究具有现实的意义，而且此研究是植物病毒学研究的一个热点。