在生产应用上，核酸酶降解核酸所获得的5c-脱氧核苷酸和5c-核苷酸可加工成各种医用药品、生化试剂、助鲜剂以及农作物促生长剂[11-13]。在生物工程、医药、食品、化妆品、农业生产和科研等领域，核酸酶的使用越来越广泛，并具有很高的经济价值。我国具有丰富的核糖核酸（RNA）资源和先进的RNA生产技术，但是将其降解为5c-核苷酸的大多数菌种所产核酸酶的酶活力低下，热稳定性不高，大大制约了我国核苷酸工业的发展。

天然存在的低温酶在低温条件下催化作用较高，但是热稳定性一般较差，不利于工业应用。因为水合反应大量放热容易导致酶的失活与副产物的增加，实际生产中就需要大量冷  却剂（液氨、冷冻盐水等）将反应温度控制在15-20℃，增加了生产成本[14-16]。研究发现，大部分热稳定性好的核酸酶的最适酶促反应温度也偏高， 而最适酶促温度接近40℃的核酸酶则热稳定性较差， 所以目前还有必要继续寻找更高耐热性优质核酸酶， 以促进核酸酶的普遍推广使用。而在已存在并投入使用的核酸酶中，为了保证核酸酶的高效利用率，提高其热稳定性是一种有效的措施。所以，筛选耐热性更好的核酸酶以及探索更好的提高核酸酶的热稳定性的方法仍是研究的重点。本实验对Y.e.p非特异性核酸酶的热稳定性的研究是使其在工商业中能够充分发挥作用的重要一步。

实验和理论的研究揭示，许多重要的结构特征都涉及影响蛋白质的热稳定性。如盐桥、疏水相互作用、氢键、填料、构想应变、二级结构、柔性和刚性等。盐桥（salt bridge），是蛋白质结构中静电作用的一种，嗜中温和嗜热蛋白之间的一个最常见的结构性差异是盐 桥的数量。一些研究指出，盐桥在嗜高温蛋白质中的作用明显，并且在这些喜温的蛋白中盐桥的数量明显增加。尤其是嗜热蛋白，在许多研究中都曾被报道。如此看来，盐桥之间的相互作用对提高嗜热菌的热稳定性有巨大作用。

定点突变包括寡核苷酸诱导的基因定点突变和依赖聚合酶链式反应（PCR）的体外诱变，是定向进化的一种方式，许多科学家在研究盐桥与蛋白质热稳定性的实验中，都采用定点突变技术以改变盐桥的结构组成，以此达到破坏盐桥的效果。本实验在研究过程中也将采用定点突变技术探究盐桥与核酸酶热稳定性的关系。

本实验所采用的Y.e.p非特异性核酸酶是一种来源于Yersinia enterocolitica subsp.Palearctica的非特异性核酸酶。实验前期，将Y.e.p非特异性核酸酶基因用Nde I 和Xho I 进行双酶切，并与同样双酶切的PET24a(+)连接，转化至大肠杆菌BL21starTM(DE3)plysS表达载体，构建好了基因工程菌。在实验中将定点突变Y.e.p非特异性核酸酶中含盐键数目最多的盐桥R63Q和含盐键数目最少的盐桥D166Q。在蛋白质浓度一致的情况下，将突变体与野生型核酸酶进行热稳定性比较，从而研究盐桥对Y.e.p非特异性核酸酶热稳定性的影响。

1. 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株与质粒  

重组质粒pET24a-nuc                   由本实验室保藏

大肠杆菌E.coli DH5α                购自北京GenStar 公司

大肠杆菌BL21starTM（DE3）plysS      购自Novagen 公司

1.1.2 酶与试剂盒  甲基化酶Dpn I、DNA Marker、BCA法测定蛋白质浓度试剂盒、2×Pfu  PCR StarMix、质粒DNA小提试剂盒、DNA胶回收试剂盒