本研究从腐烂的番茄（Solanum lycopersicum cv. Ailsa Craig）中分离主要致病菌F. oxysporum，通过相关生理、生化指标测定以及果实接种实验，对亚磷酸盐和碳酸氢钠这两种抑菌物质与病原菌生长发育的关系进行了分析，实验结果为果蔬采后病原菌的防治拓展了思路，并提供了一定的理论依据。

1.3  研究意义

 通过该实验可以大致了解F. oxysporum的一些生理特性，并根据其生理生长的特性及碳酸氢钠、亚磷酸盐2种抑菌物质对其的抑制效果，制定出农业中果蔬保存所需的最适抑制剂的量，以防止及减少果蔬保藏中受到F. oxysporum的侵害，减少每年因其造成的巨大经济损失。

2  材料与方法

2.1  菌株及主要试剂

     实验所用病原菌F. oxysporum分离于自然发病的番茄。亚磷酸、氢氧化钾、碳酸氢钠购自美国Sigma公司，PCR所需试剂及仪器购自日本TAKARA公司，其他主要试剂购自生工生物工程（上海）股份有限公司，DNeasy Plant Mini Kit（Cat. No. 69106）及Gel Extraction Kit（Cat. No.28706）购自德国Qiagen公司。番茄（Solanum lycopersicum）果实购自当地市场。

2.2  形态特征观察及rDNA-ITS鉴定病原菌

  1  群体形态

群体形态即菌落的形态。将固体培养基制成平板，以点植法接种，即用接种针尖沾取少量孢子点植在平板中心。然后于25℃培养一定时间进行观察。观察要点：

（1） 大小：反映生长或发育速度，通常测量菌落的直径。

（2） 颜色：包括菌落表面子实体、气生菌丝、菌核的颜色和基内的颜色。

（3） 菌落表面的纹饰：如皱纹、辐射沟纹、同心环、整个菌落致密或疏松等。

（4） 菌落的质地：即菌落外观呈毡状、绒毛状、棉絮状、粉粒状、革质状，有无成束状或绳状的气菌丝。

（5） 菌落的边缘：全缘、锯齿状、树枝状等。

（6） 渗出物：指菌落表面有无液滴、液滴的颜色和数量。

   2  个体形态 

将病原菌制成载片标本在显微镜下观察其个体形态。个体形态指菌丝的特征，子实体的形态(如孢子囊。子囊壳、子囊、担子果等的形态)，孢子的形态（如孢囊孢子、分生孢子、芽孢子、节孢子、厚垣孢子、卵孢子、接合孢子、担孢子等）。

   3  rDNA-ITS

    利用75%的无水乙醇对发病番茄果实进行消毒，风干后在病斑边缘去除果皮，切取面积为0.1 cm2左右的果肉置于PDA（potato dextrose agar）培养基上，25 ℃培养24  后，在菌落边缘分离菌种，转移至新的PDA培养基上，室温培养两周，观察拍照后，用含有0.05%（v/v）Tween-20的无菌水收集孢子，经四层无菌纱布过滤后使用。将孢子悬浮液加入PDB（Potato Dextrose Broth）培养基中，调节终浓度为1.0×106 spores·mL-1，摇床振荡（25 oC, 200 rpm）培养24 h后收集菌丝。液氮研磨后使用DNeasy Plant Mini Kit（Cat. No. 69106）提取病原菌基因组。利用真菌ITS通用引物（ITS4：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′，ITS5：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）进行PCR扩增（Gardes and Bruns, 1993）。PCR反应体系为ddH2O 18 µL、10×Buffer 2.5 µL、dNTP（2.5 mmol /L）1 µL、ITS4及ITS5（10 µmol /L）各1 µL、Taq酶（2.5 unit /µL）0.5 µL、模板DNA 1 µL。PCR反应参数：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、56℃ 1 min、72 ℃ 1 min，35个循环，72 ℃ 10 min。PCR产物进行琼脂糖（浓度为1%）凝胶电泳（120 v 恒电压，20 min），利用Gel Extraction Kit（Cat. No. 28706）回收目的片段，送至上海英俊生物技术有限公司测序，结果在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov /Blast.cgi中进行同源性分析，确定菌种类别。