3.3 小鼠总DNA提取 9

3.4 引物设计 9

3.5 小鼠总DNA的PCR扩增 10

3.6 琼脂糖TAE凝胶电泳分离PCR产物 11

4. 实验结果 12

4.1 温度梯度 12

4.2 PCR鉴定结果 13

4.2.1 以Cre为引物 13

4.2.2 以Sox2Cre为引物 14

4.2.3 以GFP为引物 18

1. 引言

1.1 视网膜组成及其信号传递

哺乳动物的视网膜由至少60种神经元组成，虽然种类繁多，但可分类成6类神经细胞和1类胶质细胞。这7类细胞排列组成视网膜：视网膜的最外层——外核层，由视锥细胞和视杆细胞两种感光细胞组成；内核层由双极细胞、水平细胞、无长突细胞以及Müller细胞组成；神经节细胞层中是视神经节细胞（RGCs）[1]。

两种感光细胞都可将光信号转化为电信号。视杆细胞是视神经细胞中数量最多的神经元。即便是非常弱的光线，视杆细胞也能感受到，因而全都用于夜视力，但是视杆细胞不能分辨颜色。视锥细胞用于感受较强的光照。灵长类哺乳动物的视锥细胞分为三类，分别用于感受长、中、短三种不同波长的光[2]。

水平细胞树突与感光细胞相连。当感光细胞被激活时，水平细胞通过突触连接，抑制周围的感光细胞[3,4]。水平细胞会综合几个视锥细胞的光信号，增强视觉刺激的边界效应，增加刺激位点和邻近位置的对比度[1]。

双极细胞扮演了承上启下的作用，接收感光细胞的电信号，并把信号传给无长突细胞和视神经节细胞的中间神经元。

无长突细胞是一种抑制性中间神经元。它通过反馈双极细胞和正反馈抑制视神经节，辅助早期视觉的呈现。一般情况下，无长突细胞从同一条树突延伸分叉形成突触输出到接收输入的地方，这个过程不贯穿胞体[5]。

RGCs是将视网膜信号传递给大脑的神经元。在内丛状层（IPL）中，RGCs与双极细胞和无长突细胞形成突触，或接收兴奋性突触输入，或抑制性突触输入[6]。RGCs的轴突沿着视神经投射到大脑中的视觉接受区域，之后传递给更高级的中枢[7]。

  1.2 Sox2简介

SOX家族是一类SRY(sex determination region of Y chomosome)相关基因构成的基因家族,编码一系列SOX(SRY-related HMG-box)家族的转录因子,参与胚胎发育和细胞命运决定的调控,所有成员的共同特点是均含有一个与SRY相关的HMG box同源的高度保守的HMG-box DNA结合域[8] 。其家族中有一种基因——Sox2参与胚胎发育和细胞命运决定的调控，它的基因突变将会导致双侧无眼畸形。

1.2.1 Sox2 蛋白及cDNA 序列的特点

1996 年，Collignon等人得到Sox2 的全长cDNA，全长2 418bp，它编码319 个氨基酸，分子量约为35kD 的蛋白。Sox2蛋白的N 末端第40~65个氨基酸富含疏水氨基酸，接下来是79 个氨基酸的HMG-box，紧挨HMG-box 的是一段B 组的同源序列，然后是199 个氨基酸的C末端。Sox2 的HMG-box 以高度亲和力结合特异的DNA 靶序列‘5 －(A/T)(A/T)CAA(A/T)G －3’[9]，Sox2 对靶序列的结合力KD=1.5×10-8M。