植物Clps在进化上具有一个保守的蛋白降解装置，由蛋白水解核心复合物(P环和R环)和一套附属蛋白(ClpT, ClpC, and ClpS)组成[11]。这为我们根据模式作物拟南芥中已知的叶绿体Clps序列来推测水稻Clps同源蛋白提供了可能。本研究正是基于此，对通过同源比对获得的水稻叶绿体Clps蛋白酶亚基进行体外表达，进一步通过pull-down验证它们之间的相互作用，揭示叶绿体Clps蛋白酶亚基在水稻叶绿体发育中的调控功能及其互作机制，探究Clps对叶绿体发育和生物合成的影响，为培育高光效水稻打下基础。

1 实验材料

1.1水稻材料 

    日本晴水稻（Oryza sativa L. japonica. cv. Nipponbare）是本实验室通过水培法种植获取，营养液配方见表1.1。

表1.1 水稻水培营养液配方

Fig1.1 Rice nutrient solution formula

组分 成分 浓度（mg/L）

组分INH4NO3   

CaCl2                                                

MgSO4·7H2O                     

K2SO4                                          

NaH2PO4                                          

Na2EDTA                    

FeSO4·7H2O                 

MnCl2·4H2O                     

H3BO3                                                

(NH4)6·Mo7O24·4H2O           

ZnSO4·7H2O                  

CuSO4·5H2O                  91.4

88.6

324

71.4

40.3

45.834

1.5

0.934

0.074

0.035

0.031

1.2载体和菌株 

    大肠杆菌(DH5α)和转化载体T5 zero购置于全式金公司。大肠杆菌BL21菌株购自购自杭州宝赛生物科技有限公司。各种限制性内切酶购于TAKARA和NEB公司，质粒提取试剂盒购于AXYGEN公司，T4连接酶购于GENVIEW公司，DNA提取和胶回收试剂盒购于北京鼎国公司，本实验中所用的引物由杭州SUNNY公司合成，DNA测序由华大基因完成[12]。

2 实验方法

2.1水稻总RNA的提取 

    本实验采用Trizol法提取水稻总RNA，具体过程如下，

    1）将研钵用液氮事先预冷，取0.1g-0.2g新鲜的水稻叶片，于预冷后的研钵中研磨至粉末。

    2）将以上全部粉末转移到预冷的离心管中，按50-100mg组织/1mlTrizol加入Trizol，12000r/离心5min，小心吸取上清至新的离心管中。

    3）按照200μl氯仿/ml Trizol加入氯仿，震荡混匀后室温静置15min。

    4）4℃ 12000g离心15min。

5）吸取上层水相，至另一离心管中。（注意：不要吸取中间界面。）

6）按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇混匀，室温放置5-10min。

7）4℃ 12000g离心10min，弃上清，RNA沉淀于EP管底部。