1.2.3抗体基础鉴定

1.2.3.1抗体浓度及纯度的鉴定。采用BCA法检测抗体浓度，用还原SDS-PAGE检测抗体纯度。

1.2.3.2单抗灵敏度的检测。采用间接ELISA方法，将重组人IL6R蛋白用pH为9.6的碳酸盐缓冲液稀释成0.05、0.025、0.0125、0.0063、0.0031、0ug/mL，用100uL/孔包被酶标板，抗体1ug/mL加样，然后加入优尔根过氧化物酶标记的二抗显色。通过450nm的吸光值减去3倍SD大于空白值加3倍SD确定抗体的检测限。

1.2.3.3单抗的特异性的检测。采用间接ELISA方法，将人细胞（293细胞）裂解液5μg/mL包被酶标板，检测单抗的特异性。

1.2.3.4抗体亲和力的测定。使用Fortebio公司的Octet生物分子相互作用分析仪进行IL6R单克隆抗体的亲和力测定。

1.2.3.5单抗亚型鉴定。采用HRP标记的兔抗鼠IgA、IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3对单抗进行亚类鉴定，具体方法参照Sigma试剂盒说明书。

1.2.4 IL6中和抗体的筛选

用ELISA方法来检测IL6R单克隆抗体对重组表达人IL6R蛋白的中和能力：把重组表达的重组人IL6蛋白包被在酶标板上，4℃孵育过夜，然后加入300uL封闭液进行封闭；同时加入生物素标记的重组IL6R蛋白和梯度稀释的IL6R单克隆抗体，抗体成分以稀释液为空白对照；同时以相同浓度的同亚型鼠IgG（IgG1）为对照；然后加入优尔根过氧化物酶（HRP）标记的链亲和素；孵育后加入显色液，反应终止后，450nm下测定吸光值。每步中间均进行一次洗板。计算抗体对IL6和IL6R结合的抑制率。

1.2.5检测人IL6R的酶联免疫试剂盒的制备

1.2.5.1生物素化抗体的制备。蛋白加入终体积1/10的NaHCO3(pH=8.3)加入量=蛋白体积/9*10-蛋白体积）（如果是小试得到的抗体则进行超滤，将缓冲液换到0.1M、pH=8.3的NaHCO3溶液中）；计算所需生物素的量（蛋白量*0.7），适量生物素加入抗体，室温避光反应4h；超滤将缓冲液换到PBS中。

1.2.5.2最佳抗体浓度的确定。按照紫外分光光度计法，测定抗体及抗原的浓度。

采用正交试验方法，将抗IL6R单克隆抗体、生物素标记的抗IL6R多克隆抗体

和HRP标记链亲和素分别做不同倍数稀释。综合考虑背景及重组蛋白的光吸收值，选择最佳工作浓度。

1.2.5.3IL6R酶联免疫试剂盒的检测

包被酶标板：酸盐包被缓冲液将抗IL6R抗体稀释至浓度为2ug/mL，100uL/孔，包被96孔酶标板，4℃孵育过夜。

封闭：去未包被的液体，用含0.1%Tween的PBS(PBST)200uL/孔，洗板1次。加入300uL封闭液封闭非特异性结合位点，室温孵育1h，PBST洗板2次。

加样：用含0.5%BSA的PBS稀释重组的IL6R蛋白作为检测标准品源!自`优尔~文)论(文]网[www.youerw.com，将标准品从600pg/mL起，做2倍的倍比稀释，稀释6个点，将稀释液各取100uL按照下表的顺序加入96孔酶标板中。取待测血清或血浆样本，100uL/孔加入反应孔中。室温孵育2h。洗液200uL/孔洗板3次，拍干酶标板。

检测抗体：将HRP标记抗体用0.5%BSA的PBST稀释至2μg/mL，100uL/孔加入反应孔中。室温孵育1h。洗液200uL/孔洗板3次，拍干酶标板。

显色：加入200μL新鲜配制的TMB显色液，室温反应20min。加入50uL 2M硫酸终止反应。酶标仪450nm波长的下读值。

标准曲线的建立：以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标建立对数曲线。将测得的样品OD值代入公式，算出样品中的IL6R含量。

1.2.5.4试剂盒的特异性检测。抗体的特异性，将重组的人IL6R、IL11R、OSMR、LIFR、CNTFR和小鼠IL6R稀释至50ng/ml，按上述方法测试。

1.2.5.5试剂盒的灵敏度检测。将IL6R蛋白用含0.1%BSA的PBST稀释成200，100，50，25，12.5，6.25，3.125，0 pg/mL，100uL/孔上样，其余步骤同上。