4.2实验方法...

4.2.1接菌前菌株的处理

4.2.2接种

4.2.3数据测定方法

4.3实验结果与分析..

5讨论与展望

参考文献

致谢.
1 引言铁皮石斛（Dendrobium officinale）为兰科石斛兰属多年生草本植物，又称铁皮兰，大多分布在澳大利亚、亚洲东部和东南部等国家和地区，在我国主要分布在江西、广西、贵州、云南、湖南、安徽、广东、浙江、福建等地区[1]。铁皮石斛是我国传统的珍贵中药材，有“救命仙草”、“药中黄金”、“中华仙草”等美称。《道藏》中称其为“中华九大仙草”之首。其药用历史自秦汉时期就已有记载，《神农本草经》中记载铁皮石斛有“主伤中，除痹，下气，补五脏虚劳、羸瘦，强阴。久服，厚肠胃、轻身、延年”等效果；李时珍的著作《本草纲目》中也评价其“主治胃中虚热，发热自汗，痈疽排脓内塞 ”。《中国药典》[2]中记载“益胃生津，滋阴清热，用于阴伤津亏”。经现代对其化学成分和药理作用机理的研究证明，铁皮石斛具有抗衰老、抗肿瘤、降低血糖、提高免疫功能等作用，对恶性肿瘤、胃肠道疾病、白内障、糖尿病、慢性咽炎等疾病具有很好的疗效[3]，因此国际药用植物界称其为“药界大熊猫”。由于铁皮石斛巨大的药用价值，如铁皮枫斗等产品的市场价格不菲，在高额利润的驱动下药农常年毫无节制地掠夺性采挖，致使铁皮石斛的野生资源和适宜其生长的野生环境都遭到了严重破坏。再加上铁皮石斛生长缓慢，自身繁殖能力低，且十分娇嫩，遇到强光、多雨、雪冻等环境都会死亡，因此目前还远远不能满足临床医学以及国内外市场的巨大需求。但植物的组织培养技术为濒危药用植物大量繁殖提供了可能[4]。一般的植物组织培养方法是在培养瓶中以琼脂为支持物的固体或半固体培养，这种方法需要消耗大量的人力物力，导致植物组培技术的生产成本一直居高不下，很难形成工业化生产，因此自动化和半自动化的植物生物反应器已应运而生源`自*优尔?文.论~文`网[www.youerw.com。这其中的开合式间歇浸没植物生物反应器更是其中的佼佼者，该种反应器结合了固体培养（可以最大化气体交换）和液体培养（营养可以充分的吸收）的优点，在很多种植物和体细胞胚体的培养中占有一定的优势，所获得的幼苗和体细胞胚体的质量高，玻璃化减少，更能很好的适应环境，移栽的成活率比一般传统的方法更高[5]。就像其他的兰科植物一样， 铁皮石斛也是一种典型的内生菌根植物[6-7]， 其种子极小，不含胚乳，在自然条件下需要与某些内生真菌建立共生关系才可以萌发并完成生活史。虽然目前铁皮石斛的组培技术已经成熟，但无论是传统的组培方式还是利用植物生物反应器培养组培苗，在大量生产的过程中仍然存在组培苗生长缓慢，病虫害严重、组培苗容易退化和有效成分含量低等问题，而这些问题都与组培过程中缺乏可以与其共生的真菌有关。因而研究铁皮石斛内生真菌与寄主植物间的互作具有重要意义[8-9]。
据此，本实验拟通过对铁皮石斛内生真菌进行形态特征和 ITS基因序列分析，促生活性指标的测定以及利用开合式间歇浸没植物生物反应器进行铁皮石斛组培苗和内生真菌的共生培养。共生 30d后统计苗的增值状况和叶绿素含量的变化，来检测这两株内生真菌是否对铁皮石斛的生长具有促进作用，并初步建立了利用开合式间歇浸没植物生物反应器进行植物--内生真菌双体系培养的方法，对该体系中存在的问题进行了探讨。为今后深入开展铁皮石斛与内生真菌的互作研究，筛选促生菌种和研制优良菌剂提供一定理论依据和方法体系。2 铁皮石斛内生真菌 GDB254和 GS222 的鉴定本实验通过对保藏在江苏师范大学江苏省药食植物生物技术国家重点实验室培育点的铁皮石斛内生真菌 GDB254 和GS222 菌种进行活化处理，并对其进行形态学观察、ITS基因序列分析和构建系统发育树进行同源性比对， 阐述了 GDB254 和GS222 的分类地位和基本属性，为今后进一步开发内生真菌 GDB254和 GS222提供参考价值。