2.2.5 引物设计 11

2.2.6 聚合酶链式反应（PCR） 13

2.2.7 PCR反应体系（30ul） 14

2.2.8琼脂糖TAE凝胶电泳分离PCR产物 16

第三章  实验结果分析 17

3.1 聚合酶链式反应（PCR） 17

3.1.1 温度梯度 17

3.2 琼脂糖凝胶电泳成像分析 18

3.2.1对胚胎尾巴进行DNA采集并分析 18

第四章 总结与展望 20

参考文献 21

致  谢 22

第一章 引言

1.1 基因简介

    Lac Z，即细菌β-半乳糖苷酶基因在许多小鼠研究中作为筛选标记，它是由4个亚基组成的四聚体，可催化乳糖的水解．Beta-gal比较稳定，用X-Gal为底物进行染色时，呈蓝色，便于检测和观察．LacZ基因的诸多优点使它成为基因工程实验中的一个常用标记基因，比如常用于转化菌株筛选，β-半乳糖苷酶显色反应选择法，即，蓝白筛选．例如，基因克隆中常用的质粒载体PUC 19及噬菌体载体M13系列均带有LacZ基因。

    GFP,即绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein )其自身的特点，它能够在体内或体外进行实时监测。GFP还有另一个优势，能采用流式细胞仪、共聚焦显微镜及荧光计等技术进行定量检测。目前，人们已经改进了野生型GFP基因，从中获得的几种变体在热稳定性和荧光强度等方面都有所增强。增强型GFP（EGFP）就是其中之一。现在，它已普遍应用于转基因或基因打靶小鼠。更为重要的是，人们现在已经开发出多种GFP光谱变体，其中两种全新颜色的变体——增强型黄色荧光蛋白（EYFP）和增强型蓝绿色荧光蛋白（enhanced cyan fluorescent protein, ECFP）已应用于小鼠研究中。

    由于ECFP和EYFP的谱线轮廓截然不同且没有重叠，所以这两种荧光蛋白可同时用作报告基因并共同显色，这对体内双标记或荧光能量转移分析等研究是非常理想的。GFP及其颜色变体作为报告蛋白的应用为科学研究提供了一个空前的高精度检测方法，代表着小鼠基因组改造技术的未来发展方向，并开启了在同一个动物体内应用组合无创性报告基因的广阔前景。

第二章 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验试剂                                                                           

实验使用的主要仪器及生产厂家如下：

1. Premix Ex Taq                           杭州诺扬生物技术

2. 6 × Loading buffer                        杭州诺扬生物技术

3. DM5000                                杭州诺扬生物技术

4. DNAGreen                              杭州诺扬生物技术

5. PBS（NaCl、Na2HPO4、KH2PO4、KCl）    Sigma 

6. PFA(Methanal、HCl)                      Sigma