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木霉13-1的生物功能分析+文献综述(3)
1.2.7 大豆叶片生理指标的测定
随机剪取处理组和对照组大豆植株叶片进行植物叶片中叶绿素含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白质含量、PPO活力和POD活力的测定。
植物叶片叶绿素含量的测定:
1. 称取剪碎的大豆叶片新鲜样品0.3g,放入研钵中,2mL80%丙醇,迅速研磨,将匀浆将倒入2mL EP管(eppendorf管)中,5000r/min,10min离心,抽提几次。
2. 用无水乙醇定容上清液至25mL。
3. 把叶绿素提取液摇匀后倒入比色杯中(厚度约为1cm),以80%丙醇作对照,分别在波长645nm、652nm和663nm下测定光密度值,最后计算。
植物叶片中可溶性蛋白质含量的测定:
1. 标准曲线的绘制
0-100µg标准曲线的制作,取依次编号1-6的试管优尔只,,分别加入1000µg/mL标准牛血清蛋白0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL和0.5mL;蒸馏水5mL、4.9mL、4.8mL、4.7mL、4.6mL和4.5mL;试管1-6中蛋白质含量分别为0µg、20µg、40µg、60µg、80µg和100µg。准确吸取所配的各管溶液0.1mL,分别放入10mLEP管中,并加入5mL考的马斯亮蓝G-250试剂,充分混匀,放置2min后,测定在595nm处的吸光度值,绘制标准曲线。
2. 酶液的提取
称取重约0.5g的大豆叶片,加入5mL预冷的0.1mol/L pH7.0磷酸缓冲液,在冰浴下快速研磨成匀浆(注研钵需要提前预冷),5000r/min离心10min(2~4℃),上清液为样品的提取液。吸取0.1mL样品的提取液,按上述方法操作,测得溶液在595nm处的吸光度值,根据标准曲线查出相应的蛋白质浓度。
3. 结果计算
植物叶片中可溶性糖含量的测定:
1. 绘制标准曲线
(1)配置浓度分别为0、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100mg/L。
(2)分别吸取上述糖溶液1mL,分别放入EP管中,并加入蒽酮试剂5mL,充分混匀,将装有溶液的EP管煮沸10min,取出冷却。
(3)测反应液在波长为620nm处的吸光值。
(4)用测量结果绘制标准曲线。
可溶性糖含量的测定
1. 可溶性糖的提取:
(1)称取重约0.5g的大豆叶片,剪碎,加入少许乙醇,研磨,研磨液用移液器转移到EP管中,用约70℃的热水洗涤研钵,洗液并入EP管中,再加蒸馏水3~4mL。EP管水浴约30min 70~80℃。
(2)待溶液冷却后,进行除去混合液中的蛋白质的操作,加入醋酸铅至不再形成白色沉淀为止。
(3)离心5000r/min 10min,取上清液,在上清液中加入少量草酸钠粉末,使生成草酸铅沉淀,离心5000r/min 10min,留上清液。
2. 可溶性糖含量的测定
吸取可溶性糖的提取液1mL,放入EP管里,并加入蒽酮试剂5mL混合,放于沸水浴中煮沸10min,取出冷却。然后在分光光度计波长620nm处测定吸光值,,再从标准曲线上查得提取液中糖的浓度。
多酚氧化酶活力测定:
1. 酶液的提取
称取0.3g大豆叶片,剪碎,加入3mL的0.1mol/L、pH6.5磷酸缓冲液,磨成匀浆,进行几次离心抽提,总上清液加入30%饱和度硫酸铵,离心取上清液,后加硫酸铵使达60%饱和度,离心收集沉淀。沉淀用2~3ml 0.01mol/L、pH6.5磷酸缓冲液溶解。
2. 活性酶的测定
在EP管中加入3.9mL的0.05mol/L pH5.5磷酸缓冲液、1.0mL 0.1mol/L儿茶酚,水浴37℃ 10min,取出后加入0.5mL酶液,迅速摇匀,于525nm波长测在1~2min内吸光度变化(A)值。
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