复合菌剂对四溴双酚A胁迫下大豆幼苗生长及抗氧化酶的影响(3)
1.4 仪器和设备
HH-S型水浴锅 巩义市英峪予华仪器厂
SpectrumLab22PC分光光度计 上海棱光技术有限公司
GZX-9240 MBE电热恒温鼓风干燥箱 上海博讯实业有限公司医疗设厂
SW-CJ-2FD洁净工作台 上海博讯实业有限公司医疗设备厂
LDZX-40KBS型立式电热压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂
TG16台式高速离心机 湖南仪器仪表总厂离心机厂
1.5 大豆幼苗生理指标的测定
大豆幼苗叶绿素和类胡萝卜素含量的测定采用丙酮和95％乙醇(V:V为1:1)浸提分光光度法[15]；可溶性糖含量的测定采用蒽酮比色法[16]；SOD活性的测定采用连苯三酚自氧化法[16]；POD活性的测定采用愈创木酚法[17]；CAT活性的测定采用紫外分光光度法[18]；MDA活性的测定采用硫代巴比妥酸（TBA）法[19]。
1.5.1 叶绿素和类胡萝卜素含量的测定
1.5.1.1 实验试剂
无水乙醇，80%丙酮，碳酸钙，石英砂
1.5.1.2 操作步骤
（1）取样：剪去大豆幼苗叶片，将表面的污渍清理，用剪刀剪成小片，称取0.1 g，加进25 mL容量瓶中，放进混合浸提液（无水乙醇：丙酮=5:5）20 mL。放在黑暗条件下，浸泡至叶片发白，用浸提试剂定容至25 mL，摇匀备用。
（2）吸光度测定：取提取液小心倒进光径为1 cm的比 色 皿里面进行比色。以浸提试剂为空 白测 定吸光度。分别测定OD663、OD646和OD470值。
1.5.1.3 结果计算
叶绿素a、b含量用以下公式：
Ca=12.21×OD663－2.81×OD646
Cb=20.13×OD646－5.03×OD663
类胡萝卜素浓度=（1000OD470-3.27Ca-104Cb）/229
CT=Ca＋Cb
1.5.2 可溶性糖含量的测定
1.5.2.1 实验试剂
乙醚；草酸钠；饱和醋酸铅；葡萄 糖标 准溶 液：称量放在80℃烘箱里面烘到重量不变的葡 萄糖100 mg，配出500 mL溶液，则可得到每mL含糖为200 μg的标准溶液。
蒽酮试剂：称取1 g提纯过的蒽酮，用1000 mL的稀硫酸进行定容。
稀硫酸溶液：用760 mL浓硫 酸（比 重是1.84)定容到1000 mL可得到。
1.5.2.2 操作步骤
(1) 可溶性糖的提取
称取重约0.1 g的大豆幼苗叶片，在研钵里面加入少量乙 醚，细致的磨出细腻的匀浆，放进烧杯里面，再缓慢倒进温度为70 ℃的蒸馏水洗涤研钵中残留物质，将经蒸馏水冲洗过的物质一并倒入烧杯内，之后加入蒸镏水30~40 mL。把烧杯小心的放进水浴锅里面受热，保持温度70~80℃约半小时，等到溶液至室温后加入饱和的中 性醋 酸铅溶 液，等到加进去的醋酸 铅不能够再出现白色沉淀就停止加入。然后将此混合物连同残渣一并 洗进100 mL容量瓶，加入蒸馏水直到达刻度线为止，充分的进行振 荡。用经过干燥的漏斗把溶液过滤到三角烧瓶中，在瓶子里面先放进一些草酸 钠的粉 末，去掉滤液里沉淀的醋酸 铅，去除掉成为固态了的草酸 铅，再次过滤一次溶液，最后得到的无色溶液就是可溶 性 糖的待测液。
(2) 显色及比色
用移液管取可溶性糖的待测液1 mL，移进干净的试管里，加5 mL蒽酮溶液后小心摇匀，放进煮沸的水浴锅里大概10 min，取出后让溶液自然降到室温，然后用分光光度计测量OD值，取OD625。在标准曲线中查出待测液的糖浓度，然后再计算待测液中糖含量百分比。
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