冰核基因2拷贝串联重复细胞表面展示体系的构建(2)
1.1.1 冰核蛋白的结构特性
细菌冰核蛋白INPs是由冰核基因( ina基因) 单独编码的。陆续克隆得到的ina 基因有ina Z、ina W、ina C、ina E、ina A、ina X、ina U、ina V 等基因，这些基因都是一些大小从3 600 bp 到4 000 bp 左右的开放读码框。基因序列分析结果表明，冰核蛋白基因序列的同源性为77%[2]。
根据冰核活性细菌( Ice nucleation active) 所具有的冰核活性的最高温度的差别, 将其产生的冰核活性蛋白分为三类[2]：
Ⅰ型冰核活性蛋白( A 型或Type I)，在- 5～- 2℃就有冰核活性；
Ⅱ型冰核活性蛋白( B 型或Type II) ，在- 7～- 5℃条件下有冰核活性；
Ⅲ型冰核活性蛋白( C 型或Type III) ，在- 10～- 7℃条件下有活性。
冰核细菌的冰核活性蛋白的一级结构是相似的，由三个完全独立的结构域组成[5]：N -端单一序列结构域，占整个序列的15%，该结构是相对疏水的； C-端单一序列结构域，占整个序列的4%，因富含酸性和碱性氨基酸残基而高度亲水；中间重复序列R-结构域占81% ，由冰核基因中间部分的相对保守的不完整的24 bp 周期性重复的DNA 序列GCCGGTTATGGCAGCACTGACC 编码成相对应的重复的八肽Ala-Gly-Tyr-Gly-Ser-Thr-Leu-Thr，再由八肽序列构成高度重复的四十八肽，四十八肽中特别富含Ala、Gly、Thr和Ser。
冰核蛋白的二级结构是由氢键连接而形成的β-片层结构，其重复的单位具有亲水性，因此冰核蛋白的二级结构具有显著的亲水性。冰核活性细菌正是以这种重复序列作为结晶模板，将水分子排列成细腻的冰核，于是含有冰核细菌的植物在- 2～- 5 ℃的条件下可使植物细胞内的水结冰。中心重复区域在结构上表现出高保真性，是冰核活性的重要模板。采用差速离心法分离出有活性的冰核活性蛋白组分，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明，冰核活性蛋白是由一种高保真的48 肽的单体形式装配而成的多聚体，表现冰核活性的最小结构单位是240 肽，分子量约为26 kDa[3]。
冰核蛋白基因中间重复序列R-结构域是表现冰核蛋白活性差异的主要片段。对来自于P . syringae S 203 的inaZ 冰核基因进行重排后发现，冰核基因中间重复区的肽段对冰核的形成作用是独立的，对冰核活性的表达起着重要作用。对冰核活性基因在N-结构域进行缺失研究后发现，N-结构域与INP 的活性相关，控制了Ⅰ型INP 的活性，但对Ⅱ、Ⅲ型的INP 产生了影响，这也验证了R-结构域是INP 的活性作用位点[19]。用Rwiniaure dovora 的InaU 作突变分析，结果发现，C-末端的12 个氨基酸残基并不是必需的。但是，如把包括Met29在内的C-末端的13个氨基酸全部剔除，将会导致冰核活性几乎完全丧失，且逐步缺失C-端序列会造成各种类型冰核的完全丧失[14]。对INP 基因的分析结果表明，冰核活性基因具有高度的同源性，中间重复区域是冰核蛋白的活性位点，基因的完整性是保障冰核活性的前提，是表达I型冰核活性蛋白的基础。冰核蛋白在本质上是冰核蛋白复合物，且冰核蛋白是通过PI而锚定于细胞膜上的。冰核细菌表达的强冰核活性物质仅仅依靠细菌的冰核蛋白成分是不够的，磷脂酰肌醇、磷脂是冰核蛋白复合物的主要成分，而且是必要成[10]分。Pseudomonas 和Erwinia两种冰核细菌具有磷脂酰肌醇合成酶活性。Turner 和Arellano 采用二种对PI( phosphatidyl inositol, 磷脂酰肌醇) 具有不同水解活性的酶对生物活性冰核进行处理，高度纯化的磷酸脂酶CⅡ对A 型冰核活性的选择性破坏及冰核蛋白在脱离细胞膜之后冰核活性的大大降低，证明了PI 参与了A 型冰核结构的形成，而且证明了冰核蛋白是一种PI 锚定蛋白；磷脂酰基醇和磷脂还增强了细胞膜的强度，避免了在细胞脱水收缩或再次吸水膨胀时细胞膜的破裂[10]。