2.2方法

2.2.1 外植体培养

(1)无AA(氨基酸)缓冲液处理:首先取三只母鼠在细胞间进行无菌操作(注意母鼠必须在细胞间外杀死然后放入酒精中浸泡15min,从物品传递窗传入细胞间)。然后取乳腺组织3份,分别放入装有D-Hanks液(无酚红)的培养皿中清洗干净。用消过毒的剪刀取一小块组织,将其剪成约1mm³左右的组织小块。在6孔板中每孔加入3ml的D-Hanks液,并分别标记为乳-1(R-1),乳-2(R-2),乳-3(R-3)。从各个培养皿中挑选出15块组织小块,分别放入到对应的孔板中。无AA缓冲液处理2h。(2)抑制剂处理15min:第一组加D-Hanks 液,标示为R-1;第二组加50μL DMSO,标示为R-2;第三组加50μL Lactisole,标示为R-3;(3)含抑制剂培养30min:第一组加入DMEM 6ml;第二组加入DMEM 5940μL,60μL DMSO;第三组加入5940μL DMEM和Lactisole抑制剂60μL。培养30min。(4)取组织:培养30min后,将组织小块用镊子轻轻夹出,转移到提前放入冰中预冷的2ml EP管中,夹好后迅速插入冰中。文献综述

2.2.2 提取蛋白

(1)称重:称取空的2ml EP管重量并做好记录。将装有组织小块的2ml EP管放在电子天平上称重,分别记好数据。称好后要立即插入冰中,防止蛋白变性。 (2)配制匀浆液:根据所记录的数据,计算出组织小块的净重。按实重配置匀浆液,计算方式=实重×3×1000=所需匀浆液重量(单位为μL)。首先将PhosSTOP稀释10倍(10×P酶),将cOmplete Protease Inhibitor Cocktail稀释25倍(25×C酶)。以50μL为例:加入10×P酶5μL, 25×C 2μL, 10×PBS 5μL和38μL的ddH2O。配制匀浆液时将3个样品组织总重量计算出来,并且计算出3种样品各需多少匀浆液,一起配制匀浆液,并且配制时要多配制一些,防止因误差而使匀浆液不够。称取之后,本实验组织共重0.3398g,需配制1020μL匀浆液,为防止匀浆液不够,本实验配制1900μL 匀浆液:10×P酶190μL,25×C 76μL,10×PBS 190μL和1444μL的ddH2O 。将配制好的匀浆液分别加入到放有组织小块的EP管当中。R-1中加入378μL 的匀浆液;R-2中加入317μL 的匀浆液;R-3中加入325μL 的匀浆液;(3)匀浆破碎:在加入匀浆液的每个EP管中加入1颗处理好的研磨珠(取出研磨珠在10ml的离心管中用蒸馏水震荡洗涤3次,再用75%的无水乙醇振荡洗涤3次,放入烘箱中125℃ 10分钟后取出,冷却后,浸没在无水乙醇中保存),进行配平。将配平好的样品管放入混合球磨仪适配器的相同位置一一对应,将适配器旋紧,匀浆破碎30s。(4)离心取上清:将匀浆好的样品放入离心机,14000r/min离心20min,然后取上清到标记好的1.5ml EP管中。

2.2.3 BCA定量

(1)配制BCA工作液和蛋白质标准液:每个样品做3组平行对照,因此共有9个样品,按照每个样品加入200μL的BCA工作液,为防止误差导致BCA工作液不足,配制10个样品量,共需配制2000μL的BCA工作液。按照A液:B液=50:1的比例计算出A液和B液的量,上下颠倒混匀。备用。 (2)在96孔板中先用记号笔在盖子上做好标记,选取一角进行配制,以免错记。蛋白质标准液需与样品同时配制。样品配制时首先取16μL的1×PBS加入到每个孔中,然后取4μL的蛋白样品,最后再加入200μL的BCA 工作液,全部加入后立即盖好盖子放入37 ℃保温箱中培养30min。 (3)用Synergy 2 多功能微孔板检测仪测出每个样品的OD值(OD值为稀释后上清液中蛋白浓度)。2.2.4 Western blot

(1)计算加样量:根据测得的OD值,算出所需样品量。按单次上样20μg计算。计算出每孔加样体积为5.7μL。(2)煮样:配制上样样品量(10次加样量),R-1取27μL上清,补加13μL Loading Buffer和17μL ddH2O;R-2取35μL上清,补加18μL Loading Buffer和3μL ddH2O;R-3取25μL上清,补加12μL Loading Buffer和20μL ddH2O。将配制好的样品混合均匀, PCR仪中95 ℃ 煮样10min,目的是为了使蛋白质变性。(3) SDS-PAGE配制:将玻璃板固定好,用ddH2O检验15min,看是否会漏。每次配制两块胶一起进行电泳。分离胶需配制10%的和6%的胶,每块胶都需配制5ml(配方:10%分离胶需ddH2O 1.9ml,30% Acrylamide 1.7ml,1.5MTris-HCl(PH8.8)1.3ml,10%SDS 0.05ml,10%过硫酸铵0.05ml,TEMED 0.002ml;6%分离胶需ddH2O 2.6ml,30% Acrylamide 1.0ml,1.5MTris-HCl(PH8.8)1.3ml,10%SDS 0.05ml,10%过硫酸铵0.05ml,TEMED 0.004ml,注意最后再加入TEMED,且加入后上下颠倒几下立刻灌胶)。配制好后加入玻璃板中,从一个角加入到适宜的高度,然后从中间加入去离子水压平。等看到明显分界线的时候就说明分离胶已经凝固好,小心的将上面的水倒掉,然后加入配制好的5%的浓缩胶(浓缩胶要配制2块,5ml,配方:ddH2O 3.4ml,1.0M Tris-HCl(PH6.8)0.63ml,10%SDS 0.05ml,TEMED 0.005ml, 10%过硫酸铵0.05ml,30% Acrylamide 0.83ml)。按照上面相同的方法加入,加好浓缩胶后进行括梳(有字面向外),括好之后再补加一些浓缩胶在上面。(4)拔梳:浓缩胶凝固之后,将玻璃板组装好来!自~优尔论-文|网www.youerw.com ,放入电泳槽内,加入一些电泳缓冲液在两板之间,看是否会漏,不漏的话继续加入电泳缓冲液,点样前再将梳子拔掉(拔的时候一定要缓慢的拔,防止将浓缩胶破坏掉)。(5)点样:将样品点到对应的孔内,记好顺序:左边开始点三个Loading Buffer,一个marker,然后依次为R-1,R-2,R-3,最后三个Loading Buffer。 (6)跑电泳:盖电泳槽的盖子时,一定要红对红,黑对黑。刚开始80V电压跑30min,然后换到120V跑30min后,看一下跑到哪个部位了,等蓝色标记线跑到绿色板下边沿时停止电泳(切记要随时观察,防止跑出去)。 (7)切胶:根据marker条带,选择我们想要的蛋白样点,GAPDH是37KDa,需切下25-55KDa胶;P-S6为32KDa,需切下25-40KDa的胶;S6为32KDa,需切下25-40KDa的胶;mTOR为289KDa,需切下170KDa以上的胶;Tubulin是55KDa,需切下40-70KDa胶(切胶时尽量将胶切大一点,距离比较远的片段在同一块胶上切,距离近的重新跑胶再切,防止距离短而将蛋白样品所在胶条切掉);分别量出胶的长度和宽度后将切下的胶放入转膜Buffer中(注意不要使胶干掉)。根据记录的长和宽剪下相同大小的PVDF膜。在每块膜右上角剪一个角做记号。 (8)转膜:将剪好的PVDF膜先放入甲醇(活化PVDF膜上面的正电基因,使其能更容易与带负电的蛋白质结合)中激活10s,再放入转膜Buffer中10min。准备4块厚的滤纸,用转膜Buffer浸润。转模板(黑在下,白在上)一层海绵垫,然后放上一层浸润好的滤纸,将胶条放到滤纸偏上部位,上面再放上PVDF膜(轻轻放上,不允许将其接下再放。对齐,不要产生气泡),然后再放上一层滤纸,用玻棒赶出气泡后,加上海绵垫,将转膜板夹上。黑对黑放入电泳槽中,倒入转膜Buffer,加入冰槽,350mA恒流1h。(9) 封闭(全程在摇床上进行):转膜完成后将转好的膜轻轻取下(有蛋白面朝下),放入装有1×TBST的培养皿中(一条膜放入一个培养皿中,防止叠加对实验产生影响。每个培养皿写上对应的名字,防止弄混),在摇床上清洗5min。将1×TBST倒出,加入BSA封闭液封闭1h。封闭结束后,用1×TBST洗4次,每次5min。洗完后加入对应的一抗(1:1000),4℃过夜。(10)回收一抗,用1×TBST洗4次,每次5min。加入对应的二抗,室温孵育1h。(11)回收二抗,用1×TBST洗4次,每次5min。(12)显色:遮光配显影液(1:1配制),现配现用,将洗好的膜放入多色荧光/化学发光成像工作系统当中,膜正面向上,用吸水纸吸取多余的水,在膜上加显影液,用吸管涂抹均匀,然后曝光观察收集数据。

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