2. 质粒材料 12

二、实验方法 12

1. pCAMB2300::actin:MCherry克隆重组质粒的构建 12

2. pCAMB2300::actin:MCherry克隆重组质粒的构建技术路线图 13

3. pCAMB2300::actin:MCherry克隆重组质粒的构建过程 13

4. pCAMB2300::actin:MCherry重组克隆的筛选与鉴定 15

5. 含pCAMB2300::actin:MCherry质粒的农杆菌的转化 17

6. 含pCAMBIA2300::ER：Mecherry质粒的农杆菌的转化 17

7. 含pCAMBIA2300::Tubblin：Mecherry质粒的农杆菌的转化 17

8. 含上述细胞骨架荧光标记的质粒及mFT-GFP的农杆菌的培育 17

9. 含细胞骨架荧光标记质粒及mFT-GFP的农杆菌的注射接种 17

10. mFT-GFP及细胞骨架荧光标记荧光信号在本氏烟草叶片上的检测 17

三、结果分析 17

引言

植物的生长周期过程中在到一定时期时，在相应的外界条件下，植物将从营养生长向生殖生长转变，营养枝的顶端分生组织（shoot apical meristem, SAM）就分化出生殖器官-花，最后结出果实。开花是植物从营养生殖向生殖生长转变的重要转折点，对植物生殖生长的成功至关重要。现有的研究表明，在模式植物拟南芥中FT（Flowering locus T）基因是调控开花的关键基因之一，开花调控过程是否能够正常发生进行，不仅直接影响到植物能否正常开花和结果，完成个体生长周期，而且也关系到植物的繁殖进化与环境适应性。植物的这一成花转变过程与人类的生活也密不可分，植物开出的五颜六色的鲜花既美化了人们的生活环境，之后所获得的果实和种子也是人类生活所必不可少的。因此，近年来FT（Flowering Locus T）基因及其机理等方面的研究成为高等植物花发育研究的热点，它通过整合多种开花信号途径来调控植物开花[3][4][5]，成为开花起始的重要开关[6][7][8]。虽然现阶段 FT 基因的研究已经取得了很大的进展， 但仍然存在较多问题有待进一步深入研究，比如FT 基因的运输方式以及还存在多种未知调控互作蛋白。这项实验可以通过表达载体使被荧光标记的开花基因在烟草叶片细胞中瞬时表达，来探究开花基因蛋白的定位、以及开花基因突变体的表达产物在烟草细胞中具有怎样蛋白形态特征，从而为开花基因突变体的基因、蛋白功能的研究提供有力证明。论文网

第一章 mFT-GFP融合蛋白的亚细胞定位观察

自从第一种荧光蛋白（GFP）被科学家从维多利亚发光水母（jellyfish Aequorea victoria）中发现并分离之后，这种具有生物活性的显色物质就被广泛应用在生物成像领域，这是一种性的技术进步，GFP蛋白可以单独在各种组织细胞内单独或者是和其它蛋白进行融合表达，然后在UV光线的照射下激发产生明亮的绿色荧光，这种荧光反应仅需要氧气参与其自身基团的氧化反应外，不再需要其它化学试剂，所以操作简单方便，直接使用荧光显微镜或共聚焦显微镜可进行方便的观察。这种荧光标记技术可以帮助我们清楚地观察到内源性蛋白质的活化状态，对于基因功能研究起到非常重要的作用。绿色荧光蛋白只是荧光蛋白大家族中的一员，这些荧光蛋白大部分都来自海洋腔肠动物，因为各自含有共价结构不同以及非共价环境不同的生色基团，所以可以发出不同颜色的荧光。荧光生物蛋白在多年的发展和改进后已经形成可产生不同色彩的一系列荧光蛋白，这些荧光蛋白对大多数生化环境都不太敏感，对酸性环境、金属离子、卤化物离子耐受。