3。1 实验设计方案 8

3。2 从 pSW2 中扩增 I-Sce1 基因片段 10

3。3 pSH47-Sce1 表达载体的构建 11

3。4 pSH47-Sce1-Ble 验证载体的构建 14

3。5 pSH47-Sce1-syrDE 捕捉载体的构建 16

3。6 载体构建结果与讨论 19

4 酵母细胞 TAR 表达载体的转化和方法验证 21

4。1 酿酒酵母转化方法介绍 21

4。2 TAR 表达载体的线性化验证 22

4。3 Bleomycin 片段的捕捉和方法验证 23

5 运用 CRISPR/Cas9 体系在 HS191 基因组上插入筛选标记 28

5。1 设计原理和实验步骤 28

5。2 pCas9-gen-sp 导向载体的构建 28

5。3 PHS-HR-Ble 修复载体的构建 29

5。4 PHS-HR-Ble 修复载体和 pCas9-gen-sp 导向载体共同转化 30

6 诱导型 TAR 克隆达载体捕捉 syringomycin 基因簇 31

第 II 页 本科毕业设计说明书 

6。1 获取 syringomycin 基因簇片段 31

6。2 诱导载体 pSH47-Sce1-syrDE 捕捉 syringomycin 基因簇 32

结 论 33

致 谢 34

参 考 文 献 35

附录 A 引物列表 37

附录 B 仪器列表 38

1 引言

众所周知，微生物的基因组是许多天然产物的丰富资源库，微生物能够产生大量具有生 物活性的代谢产物，目前在抗生素，抗癌药物以及杀虫剂领域都有广泛的应用。然而这些天 然产物的生物合成基因簇一般都大于 10kb，有的甚至大于 100kb[3]。对于这样的大片段基因 簇，现有的 PCR 技术和生物合成技术显然都不能够满足其扩增克隆的要求。同时，不断发展 的测序工程还发现了微生物染色体上存在着许多“孤儿基因簇”，这类基因簇在宿主中时常呈 “沉默”不表达的状态，但却存在着许多潜在的天然生物合成功能。因此，研究新的捕捉方法 将这样的基因簇捕捉到质粒载体上，并对启动子稍作修饰或者替换，然后转化到一些易生长 培养和遗传操作的异源宿主中表达研究，这种天然产物“组合生物合成”的新方式也将会是 一种发现天然产物的有效方法。本课题首先利用含有博来霉素抗性基因的 DNA 片段进行方 法测试，证明该策略的可行性，并进一步克隆了假单胞菌中的 syringomycin 基因簇。为了提 高验证效率，还利用 CRISPR-Cas9 基因编辑体系插入了博来霉素抗性筛选标记，使该体系更 加完整高效。