1。1 大片段基因簇克隆

微生物功能基因组研究中，大片段基因簇的克隆是其中最为基础和关键的步骤。目前应 用广泛的大片段基因簇的克隆策略主要有基因组文库策略，RecE 克隆策略和 TAR 克隆策略 等[3]。

1。1。1 基因组文库策略

基因组文库的构建是将含有某种生物不同基因的许多 DNA 片段，导入受体菌的群体中 储存，从而使文库中各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。因具备容量较大、遗传稳 定和易操作等特点，大片段基因组文库被广泛应用于人类、动植物和微生物的基因组研究中 [4]。其中，Cosmid 文库，BAC 文库和 YAC 文库等目前应用相对广泛。

Cosmid 文库是指含着细胞全部 mRNA 信息的 cDNA 克隆集合。YAC（yeast artificial chromosome）文库是以酵母染色体为基础建立的高等真核生物基因文库，可以用来构建复杂 的基因组文库, 满足了高等生物基因组研究的需要[4]。BAC (Bacterial Artificial Chromosome， 细菌人工染色体)文库是以细菌为宿主建立的大片段克隆载体系统，含有某种生物体全部基因 的随机片段的重组 DNA 克隆群体。相对于 YAC 基因组文库来说，BAC 文库的转化效率更高， 载体更易于分离，在大肠杆菌中能够稳定复制，并几乎不存在因自连接和同源重组形成的嵌

合现象[5]。自 1987 年 Burke 等成功将大片段 DNA 克隆到 YAC 载体开始, 大片段基因组文 库技术就逐渐在基因组学研究领域中发挥着越来越重要的作用不可替代的重要地位[4]。然而 在显著提高克隆效率的同时，但文库的随机性和筛选困难等缺陷也限制了基因组文库在大片 段基因簇领域的发展[6]。

1。1。2 同源重组策略

以限制性内切酶和连接酶为基础的传统 DNA 重组技术虽然曾在一定时间里推动了分子 生物学和遗传学的发展，但限制内切酶的局限和对 DNA 分子大小的限制也严重阻碍了大片 段克隆的发展。因此，同源重组凭借其没有酶切位点的限制和可以方便有效地对复杂、较大 的 DNA 片段进行改造和构建等优点，在生物合成领域不断得到探索和发展。同源重组的基 本原理是,两个 DNA 分子在同源序列处发生重组, 并将各自携带的遗传信息互相交换[7]。在同 源重组策略中，应用较为广泛并且比较完整的体系是大肠杆菌 Red/ET 同源重组体系和酵母 TAR 克隆体系。论文网

Red /ET 重组体系是 Red 重组和 RecE /T 重组的合称，两种重组原理相同并且可以互相 通用。完整的 Red 重组体系由 exo、bet、gam 3 个基因组成，它们分别编码 Redα、Redβ 和 Redγ 蛋白，为避免外源 DNA 被降解， Redγ 蛋白还能够抑制大肠杆菌中 RecBCD 及 SbcCD 的强核酸外切酶活性。在大肠杆菌中应用 Red /ET 重组体系，可通过线性捕获环状同源重组 法或线性捕获线性同源重组法分别直接捕获环状的质粒 DNA、BAC、基因组 DNA 和线性的 外源 DNA。这种同源重组的方法可以结合多种其他的体内基因重组操作，快速简便且精确无 突变地在宿主菌体内完成 DNA 大片段克隆[8]。但 Red /ET 克隆策略还是存在操作步骤相对复 杂，合成效率不高，和合成有效片段的比例不高等问题[3]。

1。2 TAR 克隆策略

TAR( transformation-associated recombination)克隆技术是一种能够快速、准确地从基因组 中分离得到所需基因或染色体目的片断的技术。在酵母细胞中，TAR 载体一般由酵母的中心 粒序列(CEN) 、起始复制位点(ARS)、选择性标记 M(HIS3、URA3、LUE2 等)，以及与目的 片段两端同源的同源臂序列构成[2]。

图 1。1 TAR 克隆作用机理

TAR 克隆技术可以直接从基因组中克隆目的 DNA 序列。其基本原理是将线性化的 TAR 克隆载体与片段化的基因组 DNA 同时导入酵母细胞中, 利用酵母细胞自身的高效重组体系, 使载体与基因组的同源序列间发生同源重组，促使目的基因组片段与 TAR 载体发生重组连接, 经过筛选和验证后就可以实现对目的基因簇的扩增克隆[19]。