首先，大肠杆菌是一种我们常见的菌种。人们对它的生理生化特性和细胞形态已经了解地比较深入，对于运载体导入的具体技术和培养基配制等这些方面也就更容易掌控。

其次，基因工程常用的运载体(与目的基因结合的工具)是细菌质粒(游离于细菌等微生物细胞质中的小型环状DNA分子)，而最常用的质粒又是大肠杆菌质粒，因为大肠杆菌质粒上有类似于抗青霉素基因等易于检测的标记基因，并且使目的基因在宿主细胞中复制和表达更容易。当然它的天然来源——大肠杆菌，就是最适合大肠杆菌质粒完成使命的地方。论文网

最后，大肠杆菌是一种典型兼性厌氧型的细菌，因为它的体积小，表面积与体积的比例很大，并且能释放大量能量通过利用氧气进行彻底生物氧化，因此能够与外界迅速进行能量和物质交换，并且能在体内迅速转化。通过这些流程能使大肠杆菌新陈代谢尤其迅速，就像一个效率极高的化工厂，而同真的化工厂比较，所需要的反应条件又非常温和，容易达成，它的经济效益也是显而易见的[14]。目前，常用载体主要包括PBV220、pSC101[15]、pBR322、pET-28a、pET-32a、pET-41a和PET系统等。本试验中用到的大肠杆菌表达载体是pTolo-EX5，结构图如下（图3）：

图3。 pTolo-EX5基因图谱

1。6提高可溶性蛋白表达量的方法

在大肠杆菌中，若外源蛋白高水平表达的时候，就很容易形成包涵体，给蛋白纯化等下游工作带来非常大的麻烦。还有其他的一些影响因素，例如：大肠杆菌的初始浓度、培养温度、培养时间、诱导剂的量等的不同以及当表达蛋白的分子量大于70kDa时都会造成蛋白表达量的降低。

为提高可溶性蛋白的表达量，为后期实验打好基础，可以通过以下几点提高目的蛋白的可溶性表达：

1。可以通过以下方法实现降低蛋白合成的速度

a。降低培养温度

b。启动子的选择，使用弱启动子[16]

c。使用低拷贝数的质粒表达载体

d。降低诱导物的浓度

2。改变培养基

a。培养基中加入可以帮助蛋白折叠的因子

b。加入缓冲液保持氢离子浓度指数稳定

c。加入1%的葡萄糖，抑制lac启动子

d。加入山梨糖醇等可以稳定蛋白天然结构的因子

e。加入乙醇，硫醇和二硫化物等

3。与分子伴侣或折叠酶共表达

常用分子伴侣有：DnaK-DnaJ-GrpE、GroES-GroEL、ClpB

常用的折叠酶有： PPI's、DsbA、 DsbC、DsbA、DsbC、PDI[17]

4。分泌表达，使目的蛋白分泌到周质空间

a。胞内是还原性的，周质空间的氧化性的环境有利于二硫键的形成。

b。周质空间存在折叠酶DsbC和DsbA，能够帮助蛋白正确折叠

c。周质空间很少存在有蛋白酶所以不会被水解

d。可以使对细胞有毒性的蛋白大量存在

5。与可溶性的分子伴侣（partner）融合表达

分子内伴侣为了提高蛋白表达量可能通过多种机制影响蛋白折叠[18]

6。在大肠杆菌表达宿主中插入SUMO标签

SUMO标签蛋白是一种小分子泛素样修饰蛋白（Small ubiquitin-like modifier），是泛素(ubiquitin)类多肽链超家族的重要成员之一。在一级结构上，SUMO与泛素的同源性只有18%，然而十分相似的是两者的生物学功能和它的三级结构。研究表明SUMO可以作为重组蛋白表达的分子伴侣和融合标签，不仅可以进一步提高融合蛋白的表达量，且促进靶蛋白正确折叠以及具有抗蛋白酶水解，提高重组蛋白可溶性等等功效[19]。

1。7课题研究意义