1。2  实验方法

1。2。1  DNA提取

本研究采用SDS法提取水稻基因组DNA,提取步骤如下:

1)剪下水稻叶片 2-3cm(约50-100mg),放入1。5mL的离心管中。写上标记,将离心管中放入液氮中降温,再置于全自动快速碾磨仪中振动,4500rpm1min,即获得叶片粉末;

2)加入300μLDNA 提取液并混匀,75℃恒温水浴30min,每10min振荡混匀一次;

3)加入300μL氯仿并振荡混匀,75℃恒温水浴10min后于12000rpm离心10min;

4)吸上清于新的1。5mL离心管中,加入300μL异丙醇,4℃静置10min后于12000rpm离心10min;

5)弃上清,用75%的乙醇溶液洗涤DNA沉淀,并于8500rpm离心5min;

6)弃上清,风干后加入200μL ddH2O,于-20℃保存备用;

1。2。2  分子标记检测

1。2。2。1  PCR扩增

20μLPCR反应体系如下:

组分 Component                       体积 Volume(μL)

2×Taq Mix              10

Forward primer(10μM)           1

Reverse primer(10μM)             1

DNA                 2

ddH2O          6

   

PCR扩增反应的程序为:94℃5min;94℃30sec,55℃30sec,72℃1min,35个循环;72℃10min;4℃保温;

1。2。2。2  琼脂糖凝胶电泳

1)制作琼脂糖凝胶,浓度为5。0%。取14克琼脂粉溶于280mlTAE中,微波加热至无小气泡产生即可置于平板中冷凝,约半小时;

2)取PCR产物10μL,于琼脂糖凝胶中点样;

3)在TAE电泳缓冲液中电泳,电压220V,时间约为1小时;

4)通过紫外凝胶成像系统,扫描凝胶,获得图像,分析样品与双亲标记的多态性。

2 过程与原理文献综述

2。1  实验过程

2。1。1  混池连锁标记 

从F2群体中选取20个突变表型植株,提取DNA,进行PCR扩增,凝胶电泳,根据双亲多态性不同进行筛选,多态性不同的引物即为候选引物,此时候选引物范围较大。

2。1。2  单株连锁标记     

选取F2群体中突变体表型的植株200株,提取DNA,编号1-200,取编号1-200的植株为模版,野生型水稻9311和ZH11为亲本,用110对引物进行PCR扩增,电泳后,通过紫外凝胶成像系统进行多态性分析,与ZH11多态性一致的记录为a,与9311多态性一致的记录为A,有两个或两个以上的条带的记录为h,结果发现在五号染色体上的引物的多态性较为一致,所以粗定位SG1基因位于五号染色体上PP3268和PA3010之间。

2。1。3  扩大模板数量   

扩大模板数量,另外取一批种子进行水培,进行编号,提取DNA,以此为模板,野生型水稻9311和ZH11为亲本,在五号染色体PP3268与PA3010之间设计引物,进行PCR扩增,电泳分析后确定SG1位于五号染色体上,并精细定位到PM446和YP320,其中有7个ORF,而sg1在第四个ORF上,是第1212个碱基发生突变。

2。1。4  基因克隆   

交由公司进行基因克隆 

2。2  实验原理

2。2。1  DNA提取原理

2。2。1。1  磨样

为提高DNA浓度,叶片研磨需彻底,因此采用液氮。液氮因其在常温下快速挥发的性质,是一种极强的制冷剂,可以促使水稻冻裂,为研磨带来极大便利。并且低温情况下各种酶处于低活性状态,有利于抑制Dnase的作用,保护DNA。来*自~优|尔^论:文+网www.youerw.com +QQ752018766*

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