1。3。2 酶切连接反应 8

1。3。3磁珠富集法捕获微卫星序列 9

1。3。4恢复SSR双链结构 10

1。3。5质粒连接 10

1。3。6转化克隆及测序 11

1。3。7引物设计 12

1。3。8微卫星位点多态性初筛 12

1。3。9微卫星位点多态性复筛 13

2  结果与分析 13

2。1微卫星引物筛选结果 14

2。2微卫星荧光引物筛选结果 16

3  讨论 19

参考文献 20

致谢 20

引言

狗脸水蛇(Cerberus rynchops)是蛇亚目游蛇科水游蛇亚科下的一个蛇属，也称波加丹蛇，主要分布于印度半岛、斯里兰卡、孟加拉国、缅甸、安达曼群岛等地，目前已有2个种被确认。该种水蛇主要以鱼为食，常出没于红树林水流平缓的地区和微咸的河流中，但是在深入内陆的一些有淡水的地带也可寻得其踪迹。它们具有多种颜色，如灰色、棕色、橄榄色等，有些带有深色斑点。一般体长为75-90cm，最大可达120cm。其眼睛较小，长在头顶并且很靠近嘴唇，故因其独特的头部形状得名狗脸水蛇。狗脸水蛇为后沟牙毒蛇，它们的毒性较小并且对人体的作用微弱。由于人类对杀虫剂的大量使用，造成狗脸水蛇的食物的减少，并对其繁殖有不利影响，威胁其生存。论文网

本研究旨在利用磁珠富集法制备狗脸水蛇的微卫星分子标记，有助于未来研究狗脸水蛇生物数量结构、遗传多样性及保护策略的设计。微卫星又称为简单序列重复(Simple sequence repeat, SSR)或短串联重复(Short tandem repeat STR)，是指以少数几个（多为1–6个）核苷酸为单位的多次串联重复DNA序列[1]。微卫星DNA最早是在人类基因组研究中发现的，极其丰富，分布在整个基因组中[2]。在生物遗传育种研究中，微卫星分子标记可用来分析：物种遗传多样性、群体的遗传结构及种群的亲缘关系、遗传图谱的建立和基因定位、种质资源的保护和微卫星 DNA 指纹库的建立等。

目前微卫星序列的获得主要有两种途径：一种是用经典的分子生物学方法构建富含有微卫星位点的基因组文库，通过杂交筛选出含有微卫星序列的阳性克隆，但是筛选过程较复杂，筛选效率低，需要大量的人力和资金的投入；另一种是从已知的核酸序列中进行检索，但是可检索的资源相对有限。因此，寻求新的微卫星分离方法，来加快动植物微卫星分离和应用显得异常重要。

用生物素包被的磁珠富集法分离微卫星分子标记是一种简单高效的方法[3-4]，已用于一些植物和动物微卫星分子标记的分离[5]。但在蛇类动物方面的应用较少。且目前微卫星引物仅在少数模式生物和经济价值高的农作物中得到大量的开发，而狗脸水蛇微卫星引物筛选的工作也未见报道，本研究将狗脸水蛇的DNA酶切产物与生物素标记的探针(AC)10进行杂交，构建微卫星部分基因组文库，通过磁珠富集法，捕获含有微卫星的序列，然后进行克隆，使含有微卫星序列的片断得以富集，并进行测序，获得微卫星片段的序列，利用这些序列进行引物设计，得到了8个能稳定扩增的多态性位点，并评估了位点的有效性，为狗脸水蛇遗传多样性的检测及遗传图谱构建等打下基础。