1 材料与方法

1。1  实验材料

本实验所用于研究的狗脸水蛇采集自新加坡，样本数为115个，其中母体20个，幼体95个。所有样本均保存于南京师范大学两栖爬行实验室-80°C的超低温冰箱中。

1。2试剂与仪器

由PH=8的1×TE、10%SDS、0。5 M EDTA和5 M NaCl按一定比例配置而成的裂解液、蛋白酶K、dBIOZOL基因组提取试剂（Bioer Technology）、异丙醇、75%乙醇、DNA MarkerII，用以上试剂进行DNA提取和检测。此外，微卫星筛选过程需要用到MseI限制性内切酶、MseI双链接头、MseI接头特异引物、T4连接酶、NEB缓冲液（New England Biolabs）、BSA小牛血清、1×ATP（New England Biolabs）、探针(AC)10及其对应的生物素探针、磁珠（Streptavidin Magnesphere Paramagnetic Particles，Promega）、20×SSC、10%SDS、0。15M NaOH、1。25 M HAC、1×TE、胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl、琼脂、Amp、IPTG、X-gal、大肠杆菌DH5-α、感受态细胞以及质粒 PMD 19-T对包含微卫星片段的序列进行富集并克隆测序。各个PCR扩增过程还需要用到2。5 mM dNTPs、10×PCR Buffer、Easy-Taq DNA聚合酶、多种引物以及上样缓冲液Loading Buffer。

本实验需要用到的仪器包括PCR扩增仪、恒温金属浴、高速台式离心机（德国Eppendorf公司）、小型静音离心机(美国Bio-Rad公司)、电泳仪、凝胶成像系统（美国UVP公司）、高温灭菌锅、摇床。

1。3  实验方法

1。3。1基因组DNA提取

实验前对手术剪刀进行高温灭菌（180°C，3h），待其自然冷却后剪取约120mg冰冻样本尾部肌肉加入到已经过灭菌的1。5ml Eppendor管中，经脱醇处理后向离心管中加入500ml裂解液，用手术剪刀尽可能地将肌肉组织均匀剪碎，接着加入8μL浓度为20mg/ml的蛋白酶K，置于55°C恒温金属浴中震荡消化过夜以充分裂解肌肉组织；向消化产物中加入600µL dBIOZOL试剂并加以摇晃后静置10分钟，接着置于离心机上，在15°C条件下以13000g 转速离心 10 分钟，用移液枪吸取上层清液转移到新的无菌2。0ml Eppendor管中；加入700µL异丙醇加以摇晃后静置5分钟，置于离心机上在15°C条件下以12000g 转速离心 10 分钟，弃去上清液；向沉淀物中加入1000 μL75%乙醇，为使DNA充分悬浮，将离心管上下颠倒混合多次，在15°C条件下以12000g再离心7分钟，最终获得DNA沉淀至离心管底部；将含有DNA沉淀的离心管倒置风干，待乙醇完全挥发（约1-2h）后加入200 μL无菌去离子水置于4°C条件下对DNA加以溶解；最后待DNA完全溶解后，经 A260/A280 分光检测模板浓度后分装，部分模板置于4°C短期保存备用，其余置于-20°C 冻存。文献综述

1。3。2酶切连接反应

利用限制性内切酶Mse I 对基因组DNA进行酶切，然后用T4连接酶进行连接反应，将衔接头加于酶切片段上。用于酶切连接反应的Mse I双链接头的序列如下，使用时将两接头等比例混合：JTA（5’-TACTCAGGACTCAT-3’）JTB（5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’）。

酶切连接反应体系（25μL）被置于37°C恒温金属浴中温育3h，具体如下：

DNA        0。8 µL

MseI 0。5 µL

MseI AFLP Adapter 1 µL

10×NEB Buffer  2。5 µL

BSA        0。25 µL（50 µg/mL）

T4 Ligase  0。2 µL

1×ATP  2 µL（200 µM）