1。2。7  PCR重组载体的线性化处理 11

1。2。8  体外转录 11

1。2。11 接种本氏烟草以及表型的观察 11

2 结果与分析 12

2。1 拟南芥核糖体大亚基RPL的系统进化树构建 12

2。2 AtRPL7Ae基因克隆 13

2。3 PVX/AtRPL7Ae重组载体构建及质粒线性化 14

2。4体外转录病毒重组RNA及接种 15

2。5接种后的表型观察 15

3 讨论 16

参考文献： 17

致谢 18

引言

拟南芥属于被子植物门，双子叶植物纲二年生草本。在我国内蒙、新疆、陕西、甘肃、西藏、山东、江苏、安徽、湖北、四川、云南等省区均有发现。

拟南芥的优点是植株小、结子多。拟南芥的基因组是目前已知植物基因组中最小的。拟南芥是自花受粉植物，基因高度纯合，用理化因素处理突变率很高，容易获得各种代谢功能的缺陷型。拟南芥作为经典的模式植物,是第一个完成全基因组测序的高等植物,随着研究的不断深入,越来越多的基因的功能被人们所了解,但是仍然有大量的功能未知的基因等待我们去探究。随着生物信息学,反向遗传学和现代分子生物学技术的不断进步,这些功能未知基因的定位,功能以及对于它们的表达与调控的研究,引起了人们极大的兴趣[1]。病毒由核酸分子(DNA或RNA)和蛋白质构成的，只能在活体细胞内增殖。双生病毒(geminiviruses)是DM病毒，为双联体结构，无包膜，由两个不完整的二十面体组成[2]。双生病毒科有四个属，大多数具有经济重要性的双生病毒为万叹属病毒论文网（begomoviruses)。大多数包含2个大小相近的 单链环状DNA(ssDNA)组份，大小为2。5〜3Okb，命名为DNA-A和DNA-BANA-A编码复制相关蛋白（Rep)、 复制增强蛋白（REn)、外壳蛋白（CP)和控制晚期基因表达的转录激活蛋白（TrAP)，DNA-A与病毒的 复制和介体传播有关；DNA-B编码核穿梭蛋白（NSP，nuclear shuttle protein)和运动蛋白（MP，movement protein)，与病毒在植物体内的运输和病毒的寄主范围有关[3]。而RNA病毒是植物中最普遍存在的病毒[4]。由于病毒RNA聚合酶缺少了 DNA聚合酶的纠错功能，因此RNA病毒与DNA病毒相比具有高的突变率，也因此不容易设计疫苗进行免疫治疗[5]。植物病毒在寄主细胞因子的帮助下完成复制，进一步通过胞间连丝和微管组织扩散邻近细胞或远 端组织，并与植物相互作用引起病症。而植物进化出免疫系统来抵抗病毒的侵染，目前认为是两个层面的免疫反应：1。植物通过细胞表面的跨膜识别受体识别病原物相关分子（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)所产生的免疫，称为病原物相关分子激发的免疫（PAMP-triggered immunity，PTI)； 2。植物体内的抗性基因(resistance gene)通过特异地识别病原物效应因子所产生的细胞内免疫反应，称为效应因子激发的免疫(effector-triggered immunity, ETI)[6-7]。RNA沉默介导以及及基因介导的植物对病毒抗性，是目前研究最为清楚的两种抗病毒机制。植物通过RNA沉默系统抵抗病毒侵染，同时及基因介导了植物对病毒、细菌、真菌甚至线虫等多类病原物的抗性。约有50多个抗病(resistance，R)基因从不同的植物中克隆出来，在克隆的R基因中，NBS-LRR 类(Nucleotide binding site-leucine-rich repeats)是已分离R基因中最大的含类。NBS存在于真 核生物的许多蛋白中，NBS区域主要负责ATP的水解以及释放信号。LRR是长度在24个氨基酸之内的多重重复，它是蛋白质相互作用的平台，而且是蛋白质活化作用的调控构件。NBS-LRR类型抗性基因，编码的蛋白含有胞内核苷酸结合位点（NBS)和亮氨酸重复序列（LRR) [8]。目前为止，SA、JA与ET在植物抗病中的功能研宄相对比较清楚。受到病原菌侵染后，植物体内SA水平显著提高，产生局部获得性抗性和系统获得性抗性 [9]。核糖体作为蛋白质合成的分子机器，其工作机制已经得到了比较多的研究[10]。真核生物的核糖体80S，由60S与40S的大小亚基构成。其中40S小亚基包含18S RNA及33种核糖体蛋白质，命名为Sl-S33[11-12]；而大亚基含有5S RNA、28S RNA及5。8S RNA同时还含有46种核糖体蛋白质，分别命名为 LI-L46[11,13]。拟南芥细胞质核糖体基因的突变，会导致许多表型。比如S18(RPS18A)及S13(RPS13A)基因的突变，产生不正常的叶形状，并且生长受阻[14-15]。S5(RPS5A)突变体是半显性的表型，杂合子表现为生长迟缓，纯合子是胚胎致死[16]。L24（RPL24B）基因突变后，产生雌蕊特性模式的缺陷，出现子房内雌蕊瓣膜变小的表型[17]。