3。6  重组子的鉴定 15

3。7  重组子的序列测定 15

结论 19

致谢 22

1 前言

1。1 研究背景

人类社会的存在与发展依赖于能源的使用。现如今大量的使用化石能源，破坏了生存环境，与此同时资源短缺、环境恶化成为了最为突出的民生问题。所以我们要积极努力地寻找绿色可再生的替代能源和合理地开发现存的资源。各种替代能源中，生物乙醇以其可再生性、低毒性以及环境友好性等特点成为一种发展前景良好的液体燃料[1]。生物乙醇是指通过微生物的发酵将各类生物质转化为乙醇。目前工业上乙醇大多数是以粮食作物为原料的，但其不具有可持续性，由此可见以木质纤维素为原料的燃料乙醇具有关键性作用。我国正处在工业建设的加速期，能源供需矛盾越发明显，因此国家采取了鼓励政策，并制订了相关的法律大力发展绿色可再生能源。

生物乙醇制备的关键在于纤维素的水解。纤维素(cellulose)是一种大分子物质。纤维素类物质是自然界中分布最广泛、含量最丰富、生成量最高的有机化合物，也是自然界中数量最多的可再生性物质[2]。但是，纤维素分子本身的致密结构以及由木质素和半纤维素形成的保护层使其很难降解，从而难以被动物直接消化吸收[3]，可见纤维素降解对动物的吸收具有很大的益处。

长期以来，里氏木霉(Trichoderma reesei)被认为是最有工业应用前景的纤维素酶生产菌株[4]，但是里氏木霉中的β-葡萄糖苷酶的产量非常小[5]，使得纤维素二糖和纤维素寡糖含量累积，最终导致水解反应效率下降。本实验就是通过本实验以里氏木霉QM9414为研究对象，通过对里氏木酶β-葡萄糖苷酶cel3c的克隆，为研究分析它在里氏木霉纤维素酶诱导表达过程中的作用作准备。

1。2 纤维素酶的类型

纤维素酶是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称[6]。它由结构域、连接肽域和纤维素结合区三种区域构成。目前,完全降解纤维素至少要3种纤维素酶,分别是：内切葡聚糖酶(endo-1, 4-β-D-glucanase, EC3。 2。 1。 4)作用于纤维素分子内部的非结晶区，随即水解β-1, 4糖苷键；外切葡聚糖纤维二糖水解酶(exo-1, 4-β-D-glucanase,EC3。 2。 1。 91)；β-葡萄糖苷酶(β-1, 4-glucosidase, EC3。 2。 1。 21)[7]。

1。3 纤维素酶的产生菌种

自然界里很多生物都能产生纤维素酶，小到细菌，大到动物，但它们生长缓慢，限制了其应用。而且，几乎没有哪种产纤维素酶的生物能产生足够量的胞外纤维素酶使固体纤维素彻底分解[8]。

根据所研究的纤维素酶产生菌种中得知，最多的便是真菌。主要有木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、根霉属(Rhizopus)和漆斑霉属(Myrothecium)。虽然木霉菌发酵产物中有真菌毒素，有毒性嫌疑；另一方面β-葡萄糖苷酶活力很低，致使纤维二糖在反应体系中积累而影响酶解效率，因而其应用范围受到限制[9]，但是目前，最具有潜在工业应用价值的是木霉，特别是里氏木霉(T。 reesei)[10]。因为它降解纤维素的能力强，能够大量分泌纤维素酶，且分泌的酶是胞外酶，易分离。

1。4 β-葡萄糖苷酶

1。4。1 β-葡萄糖苷酶的结构和功能

β-葡萄糖苷酶（Ec3。2。1。21)，又称β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，它能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应韵配基[11]。该酶在自然界中分布的十分广泛，1837年第一次在苦杏仁中被Liebig和Wohler发现。直到1957年，Mandels和Reese在里氏木霉中发现了纤维素酶，作为纤维素酶成分之一β-葡萄糖苷酶也被发现[12]。葡萄糖苷水解酶根据氨基酸序列被分为88个家族，而β-葡萄糖苷酶被划分在了1、3家族中。其中，第1家族来源大多为细菌、植物和哺乳动物[13]，第三家族则大多来源于植物、真菌等。糖苷水解酶家族l的典型结构具有8个(α/β)结构围成的桶状结构，也被称为4/7超家族[14]。糖苷水解家族由C-端结构域和N-端结构域组成，在C-端结构域中，His作为H﹢受体位于KHF序列中[15]；靠近N端的谷氨酸起酸/碱作用，另一谷氨基酸起亲核试剂的作用[16]。