1.1.3 酶解提取法
分别称取磨碎烘干的茶花粉10 g,按表1的条件加入纤文素酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶,酶解后在95℃下灭酶10 min,过滤,滤渣继续用水提取,提取条件同热水浸提法。
表1 不同的酶制剂作用的条件
纤文素酶 菠萝蛋白酶 中性蛋白酶
缓冲液pH 4.8 7.1 6.6
温度(℃) 55 55 40
加酶量(%) 0.5 0.5 0.5
1.1.4 超声波辅助提取法
磨碎茶花粉烘干称取10 g,料液比1 : 25,超声功率540 W,超声时间12 min,,再按热水浸提条件继续提取,重复操作2次,得到粗多糖。
1.1.5 茶树花多糖得率
茶树花多糖得率按以下公式计算:
粗多糖得率=粗多糖质量/茶树花粉的质量×100%
1.2 茶树花粗多糖理化性质的测定
1.2.1 总糖含量的测定
多糖样品中的总糖含量的测定采用硫酸-苯酚法[15]。
准确配置100 μg/mL的葡萄糖标准溶液,精密吸取 0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mL,加入浓硫酸 2.5mL,摇匀,490 nm 处的测定吸光度值。
样品中的总糖含量测定:将样品配置成适当浓度(约100 μg/mL)取1mL样品,按上述步骤操作,在490 nm 处测其吸光值,并根据标准曲线计算其总糖含量。
1.2.2 蛋白质含量的测定
多糖样品中的蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法[16]。
所用试剂:称取100mg考马斯亮蓝G-250,溶于50mL,90%的乙醇,加入100mL,85%磷酸溶液,定容至1000mL,得考马斯亮蓝工作液,中性滤纸过滤,棕色瓶保存。得到100 μg/mL牛血清白蛋白(BSA)标准溶液。
标准曲线的绘制:取上述BSA标准溶液 0.0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL至于6个试管中,去离子水补至1.0mL,涡旋均匀后加入考马斯亮蓝工作液5.0mL,混匀静置5min后,595nm测吸光值,以BSA浓度为横坐标,吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
测定多糖样品中的蛋白质含量:将样品配置成适当浓度(约5mg/mL),取1mL样品,按上述步骤测定吸光值,根据标准曲线计算蛋白质含量。
1.2.3 多酚含量测定
测定多糖样品中的多酚含量采用福林酚法[19]。
标准曲线的绘制:精密称取10mg绿原酸,定容至100mL,得0.1mg/mL的绿原酸,取上述绿原酸溶液0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL至于5个试管中,去离子水补至1.0mL,混匀。从上述五个试管中各取200μL样品,加入10%的福林酚1mL,在37℃反应5min,再加入10%Na2CO3溶液2mL,在37℃反应1h后于747nm测吸光值。
多糖样品中多酚含量的测定:将样品配成适宜浓度,取200μL样品,按上述步骤测定吸光值,按照标准曲线计算多酚含量。
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