1.3.6 凝胶保水性测定
参照卞光亮[11]等人的方法,做适当修改。
蒸煮损失(Cooking Loss,CL):取3管前一天制备的肌原纤文蛋白热诱导凝胶,擦去离心管表面的水分后称重,离心管倒置晾干,残留水分用干燥滤纸小心吸干后准确称量,取3次测量的平均值作为测定结果。蒸煮损失用蒸煮前后凝胶质量损失的百分率表示。
计算公式:
CL(%)=(蒸煮前的质量-蒸煮后的质量)/蒸煮前的质量×100
离心损失测定:参照Kocher和Foegeding等[12]离心法测量,将制成的凝胶离心(1000g,15min)后,离心管倒置晾干,残留水分用干燥滤纸吸干,记录离心前后离心管的重量,取3次测量的平均值作为测定结果。
计算公式:
WHC(%)=(离心前的质量-离心后的质量)/离心前的质量×100
1.3.7 凝胶强度测定
测定前,将蒸煮后的样品去水,在室温中放置平衡2h后用TA-XT plus质构仪进行测量,通过P/5S型金属膜测定其凝胶强度(g)。其测定参数为:测前速度:2.00mm/s;测试速度:1.00mm/s;测后速度:1.00mm/s;距离:5.000mm;触发力:3.0g,每个处理3次重复。
1.3.8 LF-NMR自旋-自旋弛豫时间(T2)测定
NMR弛豫测量方法参照韩敏仪[8]的方法,略作修改。
准备前一天已蒸煮好的未处理组、超声组、超高压组以及高压均质组的凝胶样品,干燥滤纸吸干蒸煮出的水分,切取2g左右的样品放入直径为15mm的核磁管中,注意保证凝胶的完整性,预热至32°C将样品放入分析仪器中,对样品进行LF-NMR测定。T2使用CPMG序列测量,测定参数为:测试室温度为32°C,核磁共振频率为22MHz,τ值(90º脉冲和180º脉冲之间的时间)为350μs,重复扫描32次,重复间隔时间为6.5s,得到12000个回波,每个测试进行4次重复。CPMG指数衰减曲线用仪器自带MultiExp Inv Analysis软件进行反演,得到T2值。反演结果为生成弛豫图、各个弛豫过程的弛豫峰值、其对应的时间常数及其面积分数。
1.3.9 流变特性测定
使用磷酸缓冲溶液(0.6 M KCl、20 mM K2HPO4、20 mM KH2PO4、pH 6.5)将蛋白稀释至20mg/mL,流变仪选用50mm平行板,频率为0.1Hz,应变为0.0025,保持测量板与载物台间距为0.5mm,吸取大概10mL的蛋白溶液样品均匀涂布于测试板上,去除样品中的气泡,为防止挥发,蛋白与空气接触处需用液体石蜡覆盖。测定过程中先于20°C预热3min,后以1°C的升温速率从20°C上升至80°C,测定指标为各样品的储能模量G′、相位正切角δ(tan δ=G″/G′)。每个处理测定3个重复。
1.3.10 蛋白溶解度测定
使用磷酸缓冲溶液(0.6 M KCl、20 mM K2HPO4、20 mM KH2PO4、pH 6.5)将蛋白溶液浓度稀释至10 mg/mL后,在4°C高速冷冻离心机中20000g离心30min。取上清测其蛋白浓度,每个处理进行4次重复测定,蛋白溶解度根据以下公式计算:
溶解度(%)=离心后上清液中蛋白质浓度/离心前蛋白质的浓度×100
1.3.11 活性巯基含量测定
参照 Liu等[13]的方法,稍作改进。
使用磷酸缓冲溶液(0.6 M KCl、20 mM K2HPO4、20 mM KH2PO4、pH 6.5)将蛋白溶液浓度稀释至2mg/mL,取5mL样液先于25°C下保存5min,后冰浴10min。样液中加入20μL 5, 5′-二硫基-2-硝基苯甲酸 (DTNB, 10 mM),漩涡震荡后在4°C避光保存1h。在412nm波长处测定样液吸光度,以13600L/ (mol•cm)系数计算巯基含量,每个处理重复4次,活性巯基含量的计算公式如下:
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