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    致谢 14

    引言

    氨基葡萄糖由葡萄糖的一个羟基被氨基取代形成,分子式为 C6H13O5N 。又称氨基葡糖、葡萄糖胺、葡糖胺,是一种重要的氨基己糖。氨基葡萄糖广泛存在于酵母、真菌、细菌、植物和动物体内,也是糖蛋白和蛋白聚糖的主要组成成分,氨基葡萄糖是关节软骨细胞外基质的成分,参与了关节内硫酸肝素硫、酸角质素、糖胺聚糖和透明质酸等多种分子的结构组成[1]。在医药方面,氨基葡萄糖是软骨组织的主要组成成分,以氨基聚糖聚合物的形式存在,氨基葡萄糖聚合物含量不足,可破坏软骨的完整性,导致骨关节炎[2]。补充外源性的氨基葡萄糖,可以预防和治疗骨性关节炎,而且氨基葡萄对人体没有毒害作用。还具有保护肝脏和稳定膜活动的作用[3]。日本和美国都将其作为食品原料和用于保健食品。陈忻[4]研究表明氨基葡萄糖盐酸盐对食品中常见的21种细菌、霉菌、酵母菌有很好抗菌作用,特别是对细菌,氨基葡萄糖盐酸盐浓度越高,其抑菌作用越强。因此氨基葡萄糖盐酸盐可以成为新型的天然食品防腐剂。

    代谢工程菌发酵法[4],利用代谢工程对细菌的基因改造,构建高产氨基葡萄糖的菌株。由于在发酵过程中,氨基葡萄糖对细菌细胞生长有强烈反馈抑制作用,不能在发酵液中大量积累,因此发酵液中先生成大量的乙酰氨基葡萄糖,再通过一定处理,将乙酰氨基葡萄糖转化成氨基葡萄糖。此方法不受原料的限制,生产周期短,生产强度大,得到的氨基葡萄糖无鱼腥和不会引起过敏反应,不容易污染环境,因此成了目前国内外研究的热点。目前国内生产氨基葡萄糖常用的是甲壳素酸水解法、甲壳素酶解法、霉菌发酵法。甲壳素酸水解法,用高度浓度盐酸把几丁质分解乙酰氨基葡萄糖,再将其去乙酰化成氨基葡萄糖[5],是目前最主要的方法。但是此方法生产存在很多问题:氨糖受原料的限制,得到的氨糖对人具有致敏作用,在生产过程需要大量消耗的酸碱,葡萄糖环的化学修改,容易污染环境等 [6]。甲壳素酶解法,用甲壳素酶水解甲壳素成氨糖,底物甲壳素不溶于水,从而导致转化时间长,生产强度低,使其在工业应用中有一定的局限性。尽管用含有甲壳素酶的发酵液直接进行转化,也一般需要8天时间才达到75%[7]。霉菌发酵法[8],利用霉菌发酵,再水解细胞壁,生成氨基葡萄糖,此方法耗时,产量低,生产强度低。

    酸水解法是工程菌发酵法提取和精制氨基葡萄糖常用的方法,通过把粗的原料液酸解、浓缩、脱水、析结晶、精制等步骤。因其工艺复杂,消耗大量的酸碱,容易污染环境,需要较多的人力物力,产品纯度低,因此具有很大的局限性[9]。

    TDAC是一种脱乙酰酶,并且其基因(tdac)在基因组中已经被测定了,重组 TDAC展示出对N-乙酰壳寡糖(GlcNAc2–5)有脱乙酰酶活性,脱乙酰位点在非还原性的 GlcNAc 的残基显露出独特性[10]。这个酶也能去乙酰化 GlcNAc 单体。在原始微生物中,TDAC脱乙酰酶和分解甲壳素的甲壳素酶(Tk-ChiA)、β-氨基葡萄糖苷外切酶(Tk-GlmA)将甲壳素分解氨糖(图1)。TDAC和 Tk-GlmA 的协调作用使甲壳素降解产生 GlcNAc2 。即 GlcNAc2 上有特殊位点:TDAC酶将其去乙酰化 GlcN-GlcNAc ,然后 Tk-GlmA 再把 GlcN-GlcNAc 水解 GlcN 和 GlcNAc ,随后 TDAC酶 的第二步脱乙酰作用把剩余 GlcNA c变成 GlcN。到目前为止,来源于真菌和昆虫的甲壳素去乙酰基酶,来自于根瘤菌的壳寡糖去乙酰酶(NodB),和细菌的 GlcNAc6P 去乙酰酶都是已知的催化类似去乙酰基酶,都参与 GlcNAc 单体和有联系的糖的去乙酰基作用。甲壳素酶有能力从甲壳素链中随机移走乙酰基团[11],NodB 参与有节信号的生成,和 TDAC一样,去乙酰基作用于N-乙酰基寡壳糖的非还原性 GlcNAc 残基[12]。然而它们不能作用于 GlcNAc 单体,TDAC能去乙酰基作用于GlcNAc单体和同系物一样,但是不能接受 GlcNAc6P 单体作为底物。此外,TDAC的最初的底物与上面的去乙酰基酶是没有联系的。甲壳素去乙酰基酶和 NodB 属于多糖类去乙酰基家族,GlcNAc6P 去乙酰基酶属于酰胺水解酶家族。显然,TDAC是一种新奇的酶,具有催化性质和区别于其他已知的去乙酰基酶的一级结构。

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